Merci fir besicht Nature.com.D'Versioun vum Browser Dir benotzt huet limitéiert CSS Ënnerstëtzung.Fir bescht Resultater empfeelen mir Iech eng méi nei Versioun vun Ärem Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten).An der Tëschenzäit, fir weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, weisen mir de Site ouni Styling oder JavaScript.
D'Entdeckung an d'gënschteg Notzung vun natierleche Produkter kann hëllefen d'mënschlecht Liewen ze verbesseren.Planzwachstumshemmungschemikalien gi wäit benotzt als Herbiziden fir Onkraut ze kontrolléieren.Wéinst der Bedierfnes fir verschidden Aarte vun Herbiziden ze benotzen, gëtt et e Besoin fir Verbindunge mat neie Handlungsmechanismen z'identifizéieren.An dëser Etude hu mir eng nei N-Alkoxypyrrol Verbindung, Coumamonamid, vu Streptomyces werraensis MK493-CF1 entdeckt an de komplette Syntheseprozess etabléiert.Duerch biologesch Aktivitéitsassays hu mir entdeckt datt Urs-Monoaminsäure e syntheteschen Zwëschenzäit vun Urs-Monoamid ass an e potenziellenPlanzenwachstumsinhibitor.Zousätzlech hu mir verschidden Urbenonsäure-Derivate entwéckelt, dorënner d'Urbenyloxy-Derivat (UDA), déi héich herbizid Aktivitéit huet ouni de Wuesstum vun HeLa Zellen negativ ze beaflossen.Mir hunn och fonnt datt Urmotonsäure-Derivate Planzen Mikrotubule stéieren;Zousätzlech beaflosst KAND Aktin Filamenter an induzéieren Zell Doud;Dës villsäiteg Effekter ënnerscheede sech vun deene vu bekannte Mikrotubule-Inhibitoren a proposéiere en neie Mechanismus vun der Handlung fir Ursonsäure, wat e wichtege Virdeel an der Entwécklung vun neien Herbiziden duerstellt.
D'Entdeckung an d'praktesch Uwendung vun nëtzlechen natierleche Produkter an hir Derivate ass e Mëttel fir d'Qualitéit vum mënschleche Liewen ze verbesseren.Sekundär Metaboliten produzéiert vu Mikroorganismen, Planzen an Insekten hunn zu grousse Fortschrëtter an der Medizin an der Landwirtschaft gefouert.Vill Antibiotike an Anti-Leukämie Medikamenter goufen aus natierleche Produkter entwéckelt.Zousätzlech, verschidden Zorte vuPestiziden, Fungiziden an Herbiziden ginn aus dësen natierleche Produkter extrahéiert fir an der Landwirtschaft ze benotzen.Besonnesch Onkrautbekämpfung Herbiziden si wichteg Tools fir d'Ernte nozeginn an der moderner Landwirtschaft ze erhéijen, a verschidden Aarte vu Verbindunge gi scho kommerziell benotzt.Verschidde cellulär Prozesser a Planzen, wéi Fotosynthese, Aminosäuremetabolismus, Zellmauersynthese, Reguléierung vun der Mitose, Phytohormonsignaléierung oder Proteinsynthese, ginn als typesch Ziler vun Herbiziden ugesinn.Verbindungen, déi d'Mikrotubulefunktioun hemmen, sinn eng gemeinsam Klass vun Herbiziden, déi de Planzewachstum beaflossen andeems se mitotesch Reguléierung beaflossen2.
Mikrotubule si Komponente vum Zytoskelett a si wäit an eukaryoteschen Zellen konservéiert.Den Tubulin Heterodimer besteet aus α-Tubulin a β-Tubulin, déi linear Mikrotubule Protofilamenter bilden, mat 13 Protofilamenter déi eng zylindresch Struktur bilden.Mikrotubule spille verschidde Rollen a Planzenzellen, dorënner d'Bestëmmung vun der Zellform, der Zell Divisioun, an den intrazellulären Transport3,4.Planzzellen enthalen Mikrotubule ënner der Interphase Plasma Membran, an dës sougenannte kortikale Mikrotubule gi geduecht fir d'Organisatioun vun Cellulose-Mikrofibrillen duerch d'Reguléierung vun Cellulose-Synthase-Komplexen ze kontrolléieren4,5.Cortical Mikrotubule vu Root-Epidermalzellen, déi an der Zone vun der rapider Verlängerung vum Root-Spëtzt präsent sinn, si lateral lokaliséiert, an Cellulose-Mikrofiberen verfollegen dës Mikrotubule a limitéieren d'Richtung vun der Zellexpansioun, doduerch anisotropesch Zellverlängerung ze förderen.Dofir ass d'Mikrotubule Funktioun enk mat der Planzemorphologie verbonnen.Aminosäuresubstitutiounen an Genen, déi Tubulin kodéieren, verursaachen Skew vu kortikale Mikrotubule-Arrays a lénks- oder rietssäiteg Wuesstum an Arabidopsis 6,7.Ähnlech Mutatiounen a Mikrotubule-assoziéierte Proteinen déi d'Mikrotubule Dynamik reguléieren kënnen och zu verzerrte Wuerzelwachstum8,9,10,11,12,13 féieren.Zousätzlech verursacht d'Behandlung mat Mikrotubule-stéierend Herbiziden wéi Disopyramid, och bekannt als Pretilachlor, och lénkssäiteg schräg Wuerzelwachstum14.Dës Donnéeë weisen datt präzis Reguléierung vun der Mikrotubulefunktioun kritesch ass fir d'Richtung vum Planzewachstum ze bestëmmen.
Verschidden Aarte vu Mikrotubule-Inhibitoren goufen entdeckt, an dës Medikamenter hu bedeitend Bäitrag zur Zytoskelettfuerschung gemaach, souwéi zur Landwirtschaft a Medizin2.Besonnesch Oryzalin, Dinitroanilinverbindungen, Disopyramid, Benzamid-verbonne Verbindungen, an hir Analoga kënnen d'Mikrotubulefunktioun hemmen an doduerch de Planzewachstum hemmen.Dofir gi se vill als Herbiziden benotzt.Wéi och ëmmer, well Mikrotubule e wichtege Bestanddeel vu Planzen- an Déierzellen sinn, sinn déi meescht Mikrotubule-Inhibitoren zytotoxesch fir béid Zellarten.Dofir, trotz hirer unerkannter Utilitéit als Herbiziden, gëtt eng limitéiert Unzuel vun Antimikrotubuli Agenten fir praktesch Zwecker benotzt.
Streptomyces ass eng Gattung vun der Famill Streptomyces, déi aerobe, gram-positiv, filamentös Bakterien enthält a wäit bekannt ass fir seng Fäegkeet fir eng breet Palette vu sekundäre Metaboliten ze produzéieren.Dofir gëtt et als ee vun de wichtegste Quelle vun neie biologesch aktive natierleche Produkter ugesinn.An der aktueller Studie hu mir eng nei Verbindung mam Numm Coumamonamid entdeckt, déi aus Streptomyces werraensis MK493-CF1 a S. werraensis ISP 5486 isoléiert gouf. Mat Spektralanalyse a voller Spektralanalyse gouf d'Struktur vum Coumamonamid charakteriséiert a säin eenzegaartege N-Alkoxypyrrol Skelett. bestëmmt gouf.Synthese.Ursmonsäure, e syntheteschen Zwëscheprodukt vun Ursmonoamid a seng Derivate, gouf fonnt fir de Wuesstum an d'Keimung vun der populärer Modellplanz Arabidopsis thaliana ze hemmen.An enger Struktur-Aktivitéit Bezéiungsstudie hu mir festgestallt datt eng Verbindung mat C9 modifizéiert op Ursonsäure, genannt Nonyloxy Derivat vun Ursonsäure (KAND), wesentlech den inhibitoreschen Effekt op Wuesstem a Keimung verbessert.Notamment huet den nei entdeckte Planzenwachstumsinhibitor och de Wuesstum vun Tubak a Leberwort beaflosst a war net zytotoxesch fir Bakterien oder HeLa Zellen.Ausserdeem induzéieren e puer Urmotonsäure-Derivate e verzerrte Root-Phänotyp, wat implizéiert datt dës Derivate direkt oder indirekt Mikrotubule beaflossen.Konsequent mat dëser Iddi, weisen eis Observatioune vu Mikrotubulen entweder immunhistochemesch oder mat fluoreszent Proteinen markéiert datt d'KAND Behandlung Mikrotubulen depolymeriséiert.Zousätzlech huet d'Behandlung mat Kumamotonsäure-Derivate Aktin-Mikrofilamenter gestéiert.Also hu mir en neie Planzewachstumsinhibitor entdeckt, deem säin eenzegaartege Handlungsmechanismus d'Zerstéierung vum Zytoskelett involvéiert.
Stamm MK493-CF1 gouf aus dem Buedem zu Shinagawa-ku, Tokyo isoléiert.De Stamm MK493-CF1 huet gutt verzweigt stromal Myselium geformt.Déi partiell Sequenz vun der 16S ribosomal RNS Gentherapie (1422 BP) gouf bestëmmt.Dëse Stamm ass ganz ähnlech mam S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: typesch Stamm, 99,93%).Baséierend op dësem Resultat gouf festgestallt datt dës Stamm enk mat der Aart Stamm vu S. werraensis verbonne war.Dofir, genannt mir provisoresch dëser Deformatioun S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T produzéiert och déiselwecht bioaktiv Verbindungen.Well et wéineg fréi Fuerschung fir natierlech Produkter aus dësem Mikroorganismus ze kréien, gouf weider chemesch Fuerschung duerchgefouert.No der Kultivatioun vu S. werraensis MK493-CF1 op Gerstemedium duerch Feststofffermentatioun bei 30°C fir 14 Deeg, gouf d'Medium mat 50% EtOH extrahéiert.60 ml Probe gouf gedréchent fir 59,5 mg rau Extrait ze kréien.De rau Extrait gouf ëmgedréint Phase HPLC ënnerworf fir N-methoxy-1H-Pyrrol-2-Carboxamid (1, genannt Coumamonamid, 36,0 mg) ze ginn.De Gesamtbetrag vun 1 ass ongeféier 60% vum Rohextrakt.Dofir hu mir beschloss d'Eegeschafte vum Kumamotoamid 1 am Detail ze studéieren.
Coumamonamide 1 ass e wäiss amorphous Pudder an héich Opléisung Mass Spektrometrie (HRESIMS) bestätegt C6H8N2O2 (Fig. 1).D'C2-substituéiert Pyrrolfragment vun dëser Verbindung ass charakteriséiert duerch δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH an 1H NMR Spektrum: 4,5 Hz , H-5) an δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), an den 13C NMR Spektrum weist d'Präsenz vu véier sp2 Kuelestoffatome.D'Präsenz vun enger Amidegrupp op der C2 Positioun gouf duerch HMBC Korrelatioun vum C-3 Proton zum Amidekarbonyl Kuelestoff bei δC 161.1 bewäert.Zousätzlech weisen 1H an 13C NMR Peaks bei δH 4.10 (3H, S) an δC 68.3 d'Präsenz vun N-Methoxygruppen an der Molekül un.Och wann déi richteg Positioun vun der Methoxygrupp nach net mat der spektroskopescher Analyse wéi verstäerkter Differenzspektroskopie an der nuklearer Overhauser Ofkierzung (NOEDF) bestëmmt gouf, gouf N-methoxy-1H-pyrrol-2-Carboxamid déi éischt Kandidatverbindung.
Fir déi richteg Struktur vun 1 ze bestëmmen, gouf eng total Synthese gemaach (Fig. 2a).D'Behandlung vu kommerziell verfügbaren 2-Aminopyridin 2 mat m-CPBA huet am entspriechende N-Oxid 3 a quantitativen Ausbezuele gefouert.No der 2-Aminoazidatioun vun 2 gouf d'Cyclokondensatiounsreaktioun, déi vum Abramovich beschriwwe gëtt, am Benzen bei 90 ° C duerchgefouert fir de gewënschte 1-Hydroxy-1H-Pyrrol-2-Carbonitril 5 a Gramm ze kréien.Geschwindegkeet 60% (zwee Etappen).15,16.D'Methylatioun an d'Hydrolyse vu 4 hunn dann 1-methoxy-1H-pyrrol-2-Carboxylsäure (genannt "cumotonesch Säure", 6) a gudder Ausbezuelung (70%, zwee Schrëtt).Endlech, Amidatioun iwwer Säurechlorid Zwëschenzäit 6 mat wässerlecher Ammoniak huet Kumamoto Amide 1 an 98% Ausbezuele ginn.All Spektraldaten vun synthetiséierte 1 waren ähnlech wéi isoléiert 1, sou datt d'Struktur vun 1 bestëmmt gouf;
Allgemeng Synthese an Analyse vun der biologescher Aktivitéit vun Urbenamid an Urbeninsäure.(a) Total Synthese vu Kumamoto Amide.(b) Siwen-Deeg-ale Wild-Typ Arabidopsis Columbia (Col) seedlings sech op Murashige an Skoog (MS) Placke mat coumamonamide 6 oder coumamonamide 1 um uginn Konzentratioune ugebaut.Skala Bar = 1 cm.
Als éischt hu mir d'biologesch Aktivitéite vum Urbenamid a sengen Zwëscheprodukter bewäert fir hir Fäegkeet fir de Planzewachstum ze moduléieren.Mir hunn verschidde Konzentratioune vun Ursmonamid 1 oder Ursmonsäure 6 op MS Agar Medium a kultivéiert Arabidopsis thaliana Séiwierker op dësem Medium bäigefüügt.Dës assays gewisen, datt héich Konzentratioune (500 μM) vun 6 inhibited root Wuesstem (Lalumi 2b).Als nächst hu mir verschidde Derivate generéiert andeems Dir d'N1 Positioun vu 6 ersetzt an d'Struktur-Aktivitéit Bezéiungsstudien op hinnen gemaach huet (den analoge Syntheseprozess gëtt an der Supporting Information (SI) beschriwwen).Arabidopsis Séiwierker goufen op engem Medium ugebaut, deen 50 μM Ursonsäure Derivate enthält, a Rootlängt gouf gemooss.wéi et op der Foto gewisen.Wéi an de Figuren 3a, b a S1 gewisen, hunn Coumamosäuren ënnerschiddlech Längt vun linear Alkoxyketten (9, 10, 11, 12 an 13) oder grouss Alkoxyketten (15, 16, an 17) op der N1 Positioun.D'Derivate weisen eng bedeitend Hemmung vum Rootwachstum.Zousätzlech, fonnt mir dass Applikatioun vun 200 μM 10, 11 oder 17 inhibited germination (Lalumi 3c an S2).
Etude vun der Struktur-Aktivitéit Relatioun vun Kumamoto Amide a verbonne Verbindungen.(a) Struktur a Syntheseschema vun Analoga.(b) Quantifikatioun vun der Wuerzellängt vu 7 Deeg alen Setzlinger ugebaut op MS Medium mat oder ouni 50 μM Coumamonamid Derivate.Asterisken weisen bedeitend Differenzen mat Schambehandlung (t Test, p< 0,05).n >18. Daten ginn als mëttler ± SD gewisen.nt heescht "net getest" well méi wéi 50% vun de Somen net germinéiert hunn.(c) Quantifikatioun vun der Keimungsquote vu behandelte Somen, déi fir 7 Deeg am MS Medium inkubéiert sinn mat oder ouni 200 μM Coumamonamid a verbonne Verbindungen.Asterisken weisen bedeitend Differenzen mat Schambehandlung (Chi-Square Test).n=96.
Interessanterweis huet d'Zousatz vun Alkyl-Säiteketten méi laang wéi C9 d'Inhibitiounsaktivitéit reduzéiert, wat suggeréiert datt kumamotoinsäure-verbonne Verbindunge Säiteketten vun enger gewësser Gréisst erfuerderen fir hir biologesch Aktivitéit ze weisen.
Well d'Struktur-Aktivitéitsrelatiounsanalyse gewisen huet datt C9 op Ursonsäure geännert gouf an d'Nonyloxyderivat vun Ursonsäure (nodréiglech KAND 11 bezeechent) war den effektivste Planzewachstumsinhibitor, hu mir eng méi detailléiert Charakteriséierung vu KAND gemaach 11. Behandlung vun Arabidopsis mat 50 μM KAND 11 bal komplett germination verhënnert, iwwerdeems manner Konzentratioune (40, 30, 20 oder 10 μM) vun KAND 11 inhibited Wuerzel Wuesstem an enger Portioun-ofhängeg Manéier (Lalumi 4a, b).Fir ze testen ob KAND 11 d'Wuerzelmeristem Viabilitéit beaflosst, iwwerpréift mir Rootmeristem gefierft mat Propidium Jodid (PI) a gemooss Meristem Beräich Gréisst.D'Gréisst vun der meristem vun seedlings op engem mëttel- mat 25 μM KAND-11 ugebaut war 151,1 ± 32,5 μm, iwwerdeems d'Gréisst vun der meristem vun seedlings op enger Kontroll mëttelfristeg mat DMSO ugebaut war 264,7 ± 30,8 μm (Figebam. 4c, d) , wat beweist datt KAND-11 d'zellulär Aktivitéit restauréiert.verbreet.Root Meristem.Konsequent mat dëser, KAND 11 Behandlung reduzéiert de Montant vun Zell Divisioun Marker CDKB2; 1p :: CDKB2; 1-GUS Signal an der Wuerzel meristem (Figebam. 4e) 17.Dës Resultater weisen datt KAND 11 de Wuerzelwachstum hemmt andeems d'Zellproliferatiounsaktivitéit reduzéiert gëtt.
Analyse vum inhibitoreschen Effekt vun Urbenonsäure Derivate (Urbenyloxy Derivate) op Wuesstem.(a) 7-Dag-ale Wild-Typ Col seedlings ugebaut op MS Placke mat der uginn Konzentratioune vun KAND 11. Skala Bar = 1 cm.(b) Quantifikatioun vun root Längt.Bréiwer weisen bedeitend Differenzen (Tukey HSD Test, p< 0,05).n >16. Daten ginn als mëttler ± SD gewisen.(c) Confocal microscopy vun propidium Jodid-gefiermt Wild-Typ Col Wuerzelen op MS Placke ugebaut mat oder ouni 25 μM KAND 11. White Klammeren uginn root meristem.Skala Bar = 100 µm.(d) Quantifikatioun vun der Wuerzelmeristemgréisst (n = 10 bis 11).Statistesch Differenzen goufen mat T-Test bestëmmt (p< 0,05).D'Bars representéieren déi duerchschnëttlech Meristemgréisst.(e) Differentialinterferenzkontrast (DIC) Mikroskopie vun engem Rootmeristem deen den CDKB2 Konstrukt enthält;1pro: CDKB2;1-GUS gefierft a gefierft op 5-Deeg-ale Séiwierker ugebaut op MS Placke mat oder ouni 25 µM KAND Assay.
D'Phytotoxicitéit vu KAND 11 gouf weider getest mat enger anerer dicotyledonescher Planz, Tubak (Nicotiana tabacum), an e grousse Landplanzmodellorganismus, Leberwort (Marchantia polymorpha).Wéi am Fall vun Arabidopsis, Tubak SR-1 seedlings ugebaut op mëttelfristeg mat 25 μM KAND 11 produzéiert méi kuerz Wuerzelen (Fig. 5a).Zousätzlech hunn 40 vu 48 Somen op Placke germinéiert mat 200 μM KAND 11, wärend all 48 Somen op Spottbehandelte Medien germinéiert hunn, wat beweist datt méi héich Konzentratioune vu KAND bedeitend waren (p< 0,05;chi test -square) huet d'Keimung vum Tubak hemmt.(Fig. 5b).Zousätzlech, war d'Konzentratioun vun KAND 11 datt bakteriell Wuesstem an liverwort inhibited war ähnlech zu der efficace Konzentratioun an Arabidopsis (Figebam. 5c).Dës Resultater weisen datt KAND 11 de Wuesstum vu verschiddene Planzen hemméiere kann.Mir hunn dunn déi méiglech Zytotoxizitéit vu Bärmonoamid-verbonne Verbindungen an aneren Organismen ënnersicht, nämlech mënschlech HeLa Zellen an Escherichia coli Stamm DH5α, als Vertrieder vu méi héije Déier- a Bakterienzellen, respektiv.An enger Serie vun Zell Prolifératioun assays, observéiert mir dass coumamonamide 1, coumamonamidic Seier 6, an KAND 11 net de Wuesstem vun HeLa oder E. coli Zellen bei Konzentratioune vun 100 μM Afloss (Lalumi 5d, e).
Wuesstumsinhibitioun vu KAND 11 an net-Arabidopsis Organismen.(a) Zwee-Woch-al Wild-Typ SR-1 Tubak seedlings goufen op vertikal positionéiert MS Placke mat 25 μM KAND 11 ugebaut. (b) Zwee-Wochen-al Wild-Typ SR-1 Tubak seedlings goufen op horizontal positionéiert MS Placke mat 200 μM KAND 11. (c) Zwee-Woch-ale Wild-Typ Tak-1 liverwort Knospe ugebaut op Gamborg B5 Placke mat der uginn Konzentratioune vun KAND 11. Roude Pfeile weisen Spore déi an der zwou-Wochen Inkubatioun wuessen opgehalen Period.(d) Zell Prolifératioun Assay vun HeLa Zellen.D'Zuel vun liewensfäeg Zellen war um fixen Zäit Intervalle gemooss engem Zell zielen Kit 8 (Dojindo) benotzt.Als Kontroll goufen HeLa Zellen mat 5 μg /ml Actinomycin D (Act D) behandelt, wat d'RNA-Polymerase-Transkriptioun hemmt an d'Zelltood verursaacht.Analyse goufen an triplicate gemaach.(e) E. coli Zell Prolifératioun assay.E. coli Wuesstem war vun Mooss OD600 analyséiert.Als Kontroll goufen Zellen mat 50 μg /ml ampicillin (Amp) behandelt, wat bakteriell Zellmauer Synthese hemmt.Analysë goufen an triplicate gemaach.
Fir de Mechanismus vun der Handlung vun der Zytotoxizitéit, déi duerch Uramid-verbonne Verbindungen verursaacht gëtt, z'entschlësselen, hu mir Urbeninsäure-Derivate mat moderéierten hemmend Effekter nei analyséiert.wéi et op der Foto gewisen.Wéi an den Figuren 2b, 6a gewisen, seedlings ugebaut op Agar Placke mat héije Konzentratioune (200 μM) vun urmotononic Seier 6 produzéiert méi kuerz a lénks-kromme Wuerzelen (θ = - 23,7 ± 6,1), wärend vun seedlings op der Kontroll mëttelfristeg ugebaut, seedlings produzéiert bal direkt Wuerzelen (θ = - 3,8 ± 7,1).Dëse charakteristesche Schrägwachstum ass bekannt als Resultat vun der Dysfunktioun vu kortikale Mikrotubulen14,18.Konsequent mat dëser Entdeckung hunn d'Mikrotubule-destabiliséierend Medikamenter Disopyramid an Oryzalin ähnlech Wurzelkippung ënner eise Wuesstumsbedingungen induzéiert (Fig. 2b, 6a).Zur selwechter Zäit hu mir Urmotonsäure-Derivate getest an e puer vun hinnen ausgewielt, déi a bestëmmte Konzentratioune schräg Wuerzelwachstum induzéiert hunn.D'Verbindungen 8, 9 an 15 hunn d'Richtung vum Wuerzelwachstum bei 75 μM, 50 μM, respektiv 40 μM geännert, wat beweist datt dës Verbindungen effektiv Mikrotubulen destabiliséieren (Fig. 2b, 6a).Mir hunn och déi mächtegst Ursolsäure-Derivat, KAND 11, bei enger méi niddereger Konzentratioun (15 µM) getest a fonnt datt d'Applikatioun vu KAND 11 de Wuerzelwachstum hemmt an datt d'Richtung vum Wuerzelwachstum ongläich war, obwuel se éischter no lénks hänken ( Bild C3)..Well méi héich Konzentratioune vu Mikrotubule-destabiliséierend Medikamenter heiansdo de Planzewachstum hemmen anstatt d'Wurzelkippung ze verursaachen, hu mir duerno d'Méiglechkeet bewäert datt KAND 11 d'Mikrotubule beaflosst andeems d'kortikale Mikrotubule an de Wuerzelepidermalzellen observéiert ginn.Immunohistochemie mat Anti-β-Tubulin Antikörper an Epidermalzellen vu Keimlingwurzelen, déi mat 25 μM KAND 11 behandelt goufen, huet d'Verschwannen vu bal all kortikale Mikrotubulen an Epidermalzellen an der Verlängerungszone gewisen (Fig. 6b).Dës Resultater weisen datt Kumamotonsäure a seng Derivate direkt oder indirekt op Mikrotubule handelen fir se ze stéieren an datt dës Verbindunge nei Mikrotubule-Inhibitoren sinn.
Ursonsäure a seng Derivate veränneren kortikale Mikrotubule bei Arabidopsis thaliana.(a) Root Neigungswénkel gemooss an der Präsenz vu verschiddenen Urmotonsäure-Derivate bei den uginnene Konzentratioune.D'Effekter vun zwou Verbindungen, déi bekannt sinn fir Mikrotubulien ze hemmen: Disopyramid an Oryzalin goufen och analyséiert.Den Inset weist de Standard benotzt fir de Wurzelwachstumswinkel ze moossen.Asterisken weisen bedeitend Differenzen mat Schambehandlung (t Test, p< 0,05).n >19. Skala Bar = 1 cm.(b) Kortikale Mikrotubulen an Epidermalzellen an der Verlängerungszone.Microtubules an Wild-Typ Arabidopsis Col Wuerzelen op MS Placke mat oder ouni 25 μM KAND 11 ugebaut goufen duerch immunohistochemical staining mat β-tubulin Primärschoul antibodies an Alexa Fluor-konjugéiert sekundär antibodies visualiséiert.Skala Bar = 10 µm.(c) Mitotesch Struktur vu Mikrotubulen am Rootmeristem.Microtubules sech mat immunohistochemical staining visualized.Mitotesch Strukturen, dorënner Prophasezonen, Spindelen a Phragmoplasten, goufen aus konfokale Biller gezielt.Pfeile weisen op mitotesch Mikrotubule Strukturen.Asterisken weisen bedeitend Differenzen mat Schambehandlung (t Test, p< 0,05).n >9. Skala Bar = 50 µm.
Och wann Ursa d'Fäegkeet huet d'Mikrotubulefunktioun ze stéieren, gëtt säi Handlungsmechanismus erwaart anescht ze sinn wéi typesch Mikrotubule-Depolymeriséierungsmëttelen.Zum Beispill, méi héich Konzentratioune vu Mikrotubule-Depolymeriséierungsmëttelen wéi Disopyramid an Oryzalin induzéieren anisotropesch Expansioun vun Epidermalzellen, wärend KAND 11 net.Zousätzlech, huet Co-Applikatioun vun KAND 11 an disopyramide zu engem kombinéiert disopyramide-entschlof root Wuesstem Äntwert an KAND 11-entschlof Wuesstem inhibition war observéiert (Lalumi S4).Mir analyséiert och d'Äntwert vun der hypersensitive disopyramide 1-1 (phs1-1) mutant zu KAND 11. phs1-1 huet eng net-kanonesch tubulin kinase Punkt Mutatioun a produzéiert méi kuerz Wuerzelen wann mat disopyramide9,20 behandelt.phs1-1 mutant seedlings ugebaut op Agar mëttelfristeg mat KAND 11 hu méi kuerz Wuerzelen ähnlech zu deenen op disopyramid ugebaut (Figebam. S5).
Zousätzlech, observéiert mir mitotic microtubule Strukturen, wéi prophase Zonen, spindles, an phragmoplasts, am root meristem vun seedlings behandelt mat KAND 11. Konsequent mat den Observatioune fir CDKB2; 1p :: CDKB2; 1-GUS, eng bedeitend Ofsenkung vun d'Zuel vun mitotic microtubules war observéiert (Figebam. .6c).
Fir d'Zytotoxizitéit vu KAND 11 bei subcellulärer Resolutioun ze charakteriséieren, hu mir Tubak BY-2 Suspensiounszellen mat KAND 11 behandelt an hir Äntwert observéiert.Mir hunn fir d'éischt KAND 11 zu BY-2 Zellen bäigefüügt, déi TagRFP-TUA6 ausdrécken, déi fluoreszent Mikrotubule markéieren, fir den Effekt vum KAND 11 op kortikale Mikrotubulen ze bewäerten.Cortical Mikrotubule Dicht gouf mat der Bildanalyse bewäert, déi de Prozentsaz vun Zytoskeletal Pixel ënner zytoplasmesche Pixel quantifizéiert huet.D'assay Resultater weisen, datt no Behandlung mat 50 μM oder 100 μM KAND 11 fir 1 Stonn, d'Dicht ofgeholl bedeitend op 0,94 ± 0,74% oder 0,23 ± 0,28%, respektiv, iwwerdeems d'Dicht vun Zellen mat DMSO behandelt, 61 ± 0 . % (Fig. 7a).Dës Resultater sinn konsequent mat der Observatioun an Arabidopsis datt KAND 11 Behandlung Depolymeriséierung vu kortikale Mikrotubulen induzéiert (Fig. 6b).Mir iwwerpréift och d'BY-2 Linn mat GFP-ABD-Label Actin Filamenter no Behandlung mat der selwechter Konzentratioun vun KAND 11 an observéiert, datt KAND 11 Behandlung der Actin Filamenter gestéiert.Behandlung mat 50 μM oder 100 μM KAND 11 fir 1 h bedeitend reduzéiert Actin Filament Dicht op 1,20 ± 0,62% oder 0,61 ± 0,26%, respektiv, wärend d'Dicht an DMSO-behandelt Zellen 1,69% ± 0,52% war.7b).Dës Resultater kontrastéieren mat den Effekter vu Propyzamid, deen net Aktin Filamenter beaflosst, a Latrunculin B, en Aktin Depolymerisator deen net Mikrotubulen beaflosst (SI Figure S6).Zousätzlech huet d'Behandlung mat Coumamonamid 1, Coumamonamidsäure 6 oder KAND 11 keng Mikrotubulen an HeLa Zellen beaflosst (SI Figure S7).Also gëtt de Mechanismus vun der Handlung vu KAND 11 gegleeft anescht ze sinn wéi dee vu bekannte Zytoskelett-Stéierungen.Zousätzlech huet eis mikroskopesch Observatioun vun BY-2 Zellen, déi mat KAND 11 behandelt goufen, den Ufank vum Zell Doud wärend der KAND 11 Behandlung opgedeckt a gewisen datt den Undeel vun Evans blo-gefierften Doudeg Zellen no 30 min KAND 11 Behandlung net wesentlech eropgaange sinn, wärend no 90 Minutte vun Behandlung mat 50 μM oder 100 μM KAND, d'Zuel vun dout Zellen fräi ze 43,7% oder 80,1%, respektiv (Lalumi 7c).Zesummegefaasst weisen dës Donnéeën datt den neien Ursolsäure-Derivat KAND 11 e Planzspezifesche Zytoskelett-Inhibitor ass mat engem bis elo onbekannte Mechanismus vun der Handlung.
KAND beaflosst kortikale Mikrotubule, Aktin Filamenter, a Viabilitéit vun Tubak BY-2 Zellen.(a) Visualiséierung vu kortikale Mikrotubulen an BY-2 Zellen a Präsenz vun TagRFP-TUA6.BY-2 Zellen, déi mat KAND 11 (50 μM oder 100 μM) oder DMSO behandelt goufen, goufen duerch konfokal Mikroskopie iwwerpréift.Cortical microtubule Dicht war aus micrographs vun 25 onofhängeg Zellen berechent.Bréiwer weisen bedeitend Differenzen (Tukey HSD Test, p< 0,05).Skala Bar = 10 µm.(b) Cortical Actin Filamenter an BY-2 Zellen visualiséiert a Präsenz vu GFP-ABD2.BY-2 Zellen, déi mat KAND 11 (50 μM oder 100 μM) oder DMSO behandelt goufen, goufen duerch konfokal Mikroskopie iwwerpréift.D'Dicht vu kortikalen Aktin Filamenter gouf aus Mikrographe vu 25 onofhängege Zellen berechent.Bréiwer weisen bedeitend Differenzen (Tukey HSD Test, p< 0,05).Skala Bar = 10 µm.(c) Observatioun vun doudege BY-2 Zellen vun Evans blo staining.BY-2 Zellen mat KAND 11 (50 μM oder 100 μM) oder DMSO behandelt goufen duerch hellfeldmikroskopie iwwerpréift.n=3.Skala Bar = 100 µm.
D'Entdeckung an d'Applikatioun vun neien natierleche Produkter huet zu bedeitende Fortschrëtter a verschiddenen Aspekter vum mënschleche Liewen gefouert, dorënner Medizin a Landwirtschaft.Historesch Fuerschung gouf duerchgefouert fir nëtzlech Verbindungen aus natierleche Ressourcen ze kréien.Besonnesch Actinomyceten si bekannt als nëtzlech als antiparasitesch Antibiotike fir Nematoden wéinst hirer Fäegkeet fir verschidde sekundär Metaboliten ze produzéieren wéi Avermectin, d'Leadverbindung vun Ivermectin a Bleomycin a seng Derivate, medizinesch als Antikriibsmëttel benotzt21,22.Och eng Vielfalt vun herbizide Verbindungen goufen aus Actinomyceten entdeckt, vun deenen e puer scho kommerziell benotzt ginn1,23.Dofir gëtt d'Analyse vun Aktinomycete Metaboliten fir natierlech Produkter mat gewënschten biologeschen Aktivitéiten ze isoléieren als eng effektiv Strategie.An dëser Etude hu mir eng nei Verbindung, Coumamonamid, vu S. werraensis entdeckt an erfollegräich synthetiséiert.Ursonsäure ass e syntheteschen Zwëscheprodukt vun Urbenamid a sengen Derivate.Et kann charakteristesche Root Curling verursaachen, moderéiert bis staark herbizid Aktivitéit weisen, an direkt oder indirekt Planzen Mikrotubule beschiedegen.Wéi och ëmmer, de Mechanismus vun der Handlung vun Urmotonsäure ka vun deem vun existente Mikrotubule-Inhibitoren ënnerscheeden, well KAND 11 och Aktin Filamenter stéiert an Zell Doud verursaacht, wat e Reguléierungsmechanismus suggeréiert, duerch deen Urmotonsäure a seng Derivate eng breet Palette vun Zytoskelettstrukturen beaflossen..
Weider detailléiert Charakteriséierung vun Urbenonsäure hëlleft de Mechanismus vun der Handlung vun Urbenonsäure besser ze verstoen.Besonnesch d'nächst Zil ass d'Fähigkeit vun der Ursonsäure ze evaluéieren fir un reduzéierter Mikrotubulen ze binden fir ze bestëmmen ob Ursonsäure a seng Derivate direkt op Mikrotubule handelen an se depolymeriséieren, oder ob hir Handlung zu Mikrotubule Destabiliséierung resultéiert.Zousätzlech, am Fall wou Mikrotubulen net en direkten Zil sinn, d'Identifikatioun vun der Handlungsplaz a molekulare Ziler vun Ursonsäure op Planzzellen hëllefen d'Eegeschafte vu verbonne Verbindungen a méiglech Weeër ze verbesseren fir herbizid Aktivitéit ze verbesseren.Eis Bioaktivitéitsassay huet déi eenzegaarteg zytotoxesch Fäegkeet vun Ursonsäure op de Wuesstum vu Planzen wéi Arabidopsis thaliana, Tubak a Leberwort opgedeckt, wärend weder E. coli nach HeLa Zellen betraff waren.Kleng oder keng Toxizitéit fir Déierenzellen ass e Virdeel vun Ursonsäure-Derivate wa se als Herbizid entwéckelt gi fir an oppenen landwirtschaftleche Felder ze benotzen.Tatsächlech, well Mikrotubulen allgemeng Strukturen an Eukaryoten sinn, ass hir selektiv Hemmung a Planzen eng Schlësselfuerderung fir Herbiziden.Zum Beispill, Propyzamid, e Mikrotubule-Depolymeriséierungsmëttel deen direkt un Tubulin bindt an d'Polymeriséierung hemmt, gëtt als Herbizid benotzt wéinst senger gerénger Toxizitéit fir Déierzellen24.Am Géigesaz zu Disopyramid, verwandte Benzamide hu verschidden Zilspezifizitéiten.Zousätzlech zu Planzmikrotubelen, RH-4032 oder Benzoxamid hemmt och Mikrotubule vun Déierzellen oder Oomyceten, respektiv, an Zailamid gëtt als Fungizid benotzt wéinst senger gerénger Phytotoxizitéit25,26,27.Déi nei entdeckt Bier a seng Derivate weisen selektiv Zytotoxizitéit géint Planzen, awer et ass derwäert ze notéieren datt weider Ännerungen hir Zilspezifizitéit änneren kënnen, potenziell zousätzlech Derivate fir d'Kontroll vu pathogene Pilze oder Oomyceten ubidden.
Déi eenzegaarteg Eegeschafte vun Urbenonsäure a seng Derivate si nëtzlech fir hir Entwécklung als Herbiziden a benotzt als Fuerschungsinstrumenter.D'Wichtegkeet vum Zytoskelett bei der Kontroll vun der Planzzellform ass wäit unerkannt.Fréier Studien hu gewisen datt Planzen komplex Mechanismen vun der kortikaler Mikrotubuleorganisatioun evoluéiert hunn andeems d'Mikrotubule Dynamik kontrolléiert fir d'Morphogenese richteg ze kontrolléieren.Eng grouss Zuel vu Molekülle verantwortlech fir d'Reguléierung vun der Mikrotubuleaktivitéit goufen identifizéiert, a verwandte Fuerschung ass nach ëmmer amgaang3,4,28.Eist aktuellt Verständnis vun der Mikrotubule Dynamik a Planzenzellen erklärt d'Mechanismen vun der kortikaler Mikrotubule Organisatioun net voll.Zum Beispill, obwuel souwuel Disopyramid wéi och Oryzalin Mikrotubule kënnen depolymeriséieren, verursaacht Disopyramid eng schwéier Wurzelverzerrung, während Oryzalin e relativ mëllen Effekt huet.Ausserdeem verursaache Mutatiounen am Tubulin, wat Mikrotubule stabiliséiert, och Dextrorotatioun a Wuerzelen, wärend Paclitaxel, wat och Mikrotubule Dynamik stabiliséiert, net.Dofir, d'Studie an d'Identifikatioun vun de molekulare Ziler vun Ursolsäure sollten nei Abléck an d'Reguléierung vu Planzkortikale Mikrotubulen ubidden.Och zukünfteg Vergläicher vu Chemikalien, déi effektiv sinn fir verzerrte Wuesstum ze förderen, wéi Disopyramid, a manner effektiv Chemikalien, wéi Oryzalin oder Kumamotorsäure, ginn Hiweiser fir wéi verzerrte Wuesstum geschitt.
Op der anerer Säit, Verteidegungsrelatéiert Zytoskeletal Ëmännerungen sinn eng aner Méiglechkeet fir d'Zytotoxizitéit vun Ursonsäure z'erklären.Infektioun vun engem Pathogen oder Aféierung vun engem Elicitor an Planzzellen verursaacht heiansdo Zerstéierung vum Zytoskelett a spéider Zell Doud29.Zum Beispill, oomycete-ofgeleet Kryptoxanthin gouf gemellt fir Mikrotubulen an Aktinfilamenter virum Tubakzell Doud ze stéieren, ähnlech wéi wat mat der KAND Behandlung geschitt30,31.D'Ähnlechkeeten tëscht Verteidegungsreaktiounen an Zellreaktiounen, déi vun Ursonsäure induzéiert goufen, hunn eis zu Hypothesen gefouert datt se gemeinsame celluläre Prozesser ausléisen, obwuel e méi séier a méi staark Effekt vun Ursonsäure wéi Kryptoxanthin evident ass.Wéi och ëmmer, Studien hu gewisen datt d'Stéierung vun Aktin Filamenter spontan Zell Doud fördert, wat net ëmmer duerch Mikrotubule Stéierung29 begleet gëtt.Ausserdeem bleift et ze gesinn, ob entweder de Pathogen oder den Elicitor de verzerrte Wuerzelwachstum verursaacht, wéi Ursonsäure-Derivate maachen.Also, molekulare Wëssen, déi Verteidegungsreaktiounen an den Zytoskelett verbënnt, ass en attraktive Problem fir unzegoen.Duerch d'Exploitatioun vun der Präsenz vun nidderegen molekulare Gewiichtsverbindungen am Zesummenhang mat Ursonsäure, wéi och eng Rei vun Derivate mat ënnerschiddleche Potenz, kënne se Méiglechkeeten ubidden fir onbekannt cellulär Mechanismen ze zielen.
Zesummegefaasst wäert d'Entdeckung an d'Applikatioun vun neie Verbindungen, déi d'Mikrotubule-Dynamik moduléieren, mächteg Methoden ubidden fir déi komplex molekulare Mechanismen unzegoen, déi d'Planzzellformbestëmmung ënnerleien.An dësem Kontext kann déi kierzlech entwéckelt Verbindung Urmotonsäure, déi Mikrotubule an Aktin Filamenter beaflosst an den Zell Doud induzéiert, eng Geleeënheet bidden d'Verbindung tëscht Mikrotubule Kontroll an dësen anere Mechanismen z'entschlësselen.Also, chemesch a biologesch Analyse mat Urbenonsäure hëlleft eis d'molekulare Reguléierungsmechanismen ze verstoen déi d'Planzzytoskelett kontrolléieren.
Inokulatioun S. werraensis MK493-CF1 an eng 500 mL baffled Erlenmeyer Kolben mat 110 mL Sommedium besteet aus 2% (w/v) Galaktose, 2% (w/v) Essence Paste, 1% (w/v) Bacto Zesummesetzung .-Soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) Maisextrakt (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 an 0,2% CaCO3 an deioniséiertem Waasser.(pH 7,4 virun Sterilisatioun).D'Somenkulturen goufen op engem Rotary Shaker (180 rpm) bei 27 ° C fir 2 Deeg inkubéiert.Produktioun Kultivatioun iwwer Feststofffermentatioun.D'Somenkultur (7 ml) gouf an eng 500 ml K-1 Flask transferéiert mat 40 g Produktiounsmëttel besteet aus 15 g presséiert Gerste (MUSO Co., Ltd., Japan) an 25 g deioniséiertem Waasser (pH net ugepasst). virun der Sterilisatioun).).D'Fermentatioun gouf bei 30 ° C am Däischteren fir 14 Deeg duerchgefouert.D'Fermentatiounsmaterial gouf mat 40 ml / Fläsch EtOH extrahéiert an centrifugéiert (1500 g, 4 ° C, 10 min).D'Kultursupernatant (60 ml) gouf mat enger Mëschung aus 10% MeOH / EtOAc extrahéiert.Déi organesch Schicht gouf ënner reduzéierten Drock verdampft fir e Rescht (59,5 mg) ze kréien, deen HPLC mat Gradientelutioun (0-10 Minutten: 90%) op enger ëmgedréiter Phase Kolonn (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID ënnerworf gouf) 10 mm × Längt 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 Minutten: 90% H2O/CH3CN bis 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 Minutten: 90% H2O/EtOH, 45–155 Minutten: 90% H2O /EtOH op 100% EtOH (gradient (gradient), 155-200 min: 100% EtOH) bei enger Flowrate vun 1,5 ml / min, Coumamonamid (1, 36,0 mg) gouf als wäiss amorph Pudder isoléiert.
Kumamotoamid (1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H).4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ Berechent Wäert: 141,0659, gemooss: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1593 cm–15.
Columbia Some (Col-0) goufen aus der Arabidopsis Biologesch Ressourcen Center (ABRC) mat Erlaabnis fir Fuerschung benotzt kritt.Col-0 Somen goufen propagéiert an ënner eise Labobedingunge gehal an als Wild-Typ Arabidopsis Planzen benotzt.Arabidopsis Somen goufen Uewerfläch steriliséiert a kultivéiert an hallefstäerkt Murashige a Skoog Medium mat 2% Saccharose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-Morpholino) Ethansulfonsäure (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) ).) an 1,5% Agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, bei 23 °C a konstant Liicht.Somen vum phs1-1 Mutant goufen vum T. Hashimoto (Nara Institut fir Wëssenschaft an Technologie) geliwwert.
Somen vum Stamm SR-1 goufen vum T. Hashimoto (Nara Institut fir Wëssenschaft an Technologie) zur Verfügung gestallt an als Wild-Typ Tubaksplanzen benotzt.Tubak Somen goufen Uewerfläch steriliséiert an dräi Nuechten am sterile Waasser getäuscht fir Keimung ze förderen, duerno an eng hallefstäerkt Léisung plazéiert mat 2% Saccharose, 0,05% (w/v) MES, an 0,8% Gellan Gummi (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.a Skoog Medium) mat pH 5,7 a bei 23 ° C ënner konstantem Liicht inkubéiert.
Stamm Tak-1 gouf vum T. Kohchi (Kyoto Universitéit) geliwwert a gouf als Standard experimentell Eenheet fir d'Leberwortstudie benotzt.Gemma gouf aus steriliséierte kultivéierte Planzen kritt an duerno op Gamborg B5 Medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) platéiert mat 1% Saccharose an 0,3% Gellan Gummi a bei 23 ° C ënner kontinuéierlecher Liicht inkubéiert.
Tubak BY-2 Zellen (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) goufen duerch S. Hasezawa (Universitéit vun Tokyo) gëtt.BY-2 Zellen goufen 95-fache am modifizéierten Linsmeier a Skoog Medium verdünnt a wöchentlech mat 2,4-Dichlorophenoxyacetic Seier 32 ergänzt.D'Zellsuspension gouf op engem Rotary Shaker bei 130 rpm bei 27 ° C an der Däischtert gemëscht.Wäscht d'Zellen mat 10 Mol de Volume vum frësche Medium a resuspendéiert am selwechte Medium.BY-2 transgenic Zell Linnen stabil ausdrécken de microtubule Marker TagRFP-TUA6 oder der actin Filament Marker GFP-ABD2 ënnert der Choufleur Mosaik Virus 35S Promoteur sech generéiert wéi beschriwwen33,34,35.Dës Zelllinne kënnen erhale a synchroniséiert ginn mat Prozeduren ähnlech wéi déi, déi fir d'Original BY-2 Zelllinn benotzt ginn.
HeLa Zellen goufen an Dulbecco's modifizéierten Eagle's Medium (DMEM) (Life Technologies) kultivéiert, ergänzt mat 10% Fetal Bovine Serum, 1,2 U /ml Penicillin, an 1,2 μg /ml Streptomycin an engem 37 ° C Inkubator mat 5% CO2.
All Experimenter an dësem Manuskript beschriwwe goufen am Aklang mat japanesche Biosécherheetsreglementer a Richtlinnen gesuergt.
D'Verbindunge goufen an Dimethylsulfoxid (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) als Stammléisungen opgeléist an am MS Medium fir Arabidopsis an Tubak oder Gamborg B5 Medium fir Liverwort verdünnt.Fir d'Wurzelwachstum-Inhibitiounsassay, goufen méi wéi 10 Somen pro Plack op Agarmedium gesaat, deen déi uginn Verbindungen oder DMSO enthält.Somen goufen an enger Wuestumskammer fir 7 Deeg inkubéiert.D'Setzlinger goufen fotograféiert an d'Längt vun de Wuerzelen gemooss.Fir Arabidopsis Keimungsanalyse goufen 48 Somen pro Plack op Agarmedium gesaat mat 200 μM Verbindung oder DMSO.Arabidopsis Somen goufen an enger Wuestumskammer ugebaut an d'Zuel vun de germinéierte Setzlinger gouf 7 Deeg no der Keimung (Dag) gezielt.Fir Tubak Keimungsanalyse goufen 24 Somen pro Plack op Agarmedium gesaat mat 200 μM KAND oder DMSO.Tubak Somen goufen an engem Wuesstem Chamber ugebaut an d'Zuel vun germinated seedlings gouf no 14 Deeg gezielt.Fir de Liverwort Wuesstem Inhibitioun assay, goufen 9 Embryonen aus all Plack op Agar mëttelfristeg plated mat der uginn Konzentratioune vun KAND oder DMSO an an engem Wuesstem Chamber fir 14 Deeg incubated.
Benotzt seedlings gefierft mat 5 mg / ml Propidium Jodid (PI) root Meristem Organisatioun ze visualiséieren.PI Signaler goufen duerch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet mat engem TCS SPE konfokale Laser Scannermikroskop (Leica Microsystems).
Histochemical staining vun Wuerzelen mat β-glucuronidase (GUS) war no de Protokoll vun Malami an Benfey36 beschriwwe gesuergt.Seedlings goufen iwwer Nuecht an 90% Aceton fixéiert, mat 0,5 mg /ml 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-d-Glukuronsäure am GUS-Puffer fir 1 Stonn gefierft an an enger hydratiséierter Chloraldehyd-Léisung plazéiert.(8 g Chloralhydrat, 2 ml Waasser an 1 ml Glycerin) a observéiert duerch Differentialinterferenz Kontrastmikroskopie mat engem Axio Imager M1 Mikroskop (Carl Zeiss).
Root Wénkel goufen op 7-Deeg-ale Séiwierker gemooss, déi op vertikal plazéierte Placke gewuess sinn.Maacht de Wénkel vun der Wuerzel aus der Richtung vum Gravitatiounsvektor wéi am Schrëtt 6 beschriwwen.
D'Arrangement vu kortikale Mikrotubule gouf beobachtet wéi beschriwwen, mat klengen Ännerungen am Protokoll 37.Anti-β-Tubulin Antikörper (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) an Alexa Fluor 488-konjugéiert Anti-Maus IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) goufen als primär a sekundär Antikörper bei 1:1000 an 1:100 Verdünnungen benotzt, respektiv.Fluoreszenz Biller goufen mat engem TCS SPE konfokale Laser Scannermikroskop (Leica Microsystems) opkaf.Kaaft Z-Stack Biller a kreéiert maximal Intensitéit Projektiounen no den Instruktioune vum Hiersteller.
HeLa Zell Prolifératioun assay war mat Zell zielen Kit gesuergt 8 (Dojindo) no den Hiersteller d'Instruktioune.
De Wuesstum vun E. coli DH5α gouf analyséiert andeems d'Zelldicht an der Kultur mat engem Spektrofotometer bei 600 nm (OD600) gemooss gouf.
Cytoskeletal Organisatioun an transgenen BY-2 Zellen gouf observéiert mat engem Fluoreszenzmikroskop ausgestatt mat engem CSU-X1 konfokale Scannerapparat (Yokogawa) an enger sCMOS Kamera (Zyla, Andor Technology).D'Zytoskeletal Dicht gouf duerch Bildanalyse bewäert, wat de Prozentsaz vun Zytoskeletal Pixel tëscht zytoplasmesche Pixel a konfokale Biller mat ImageJ Software quantifizéiert huet wéi beschriwwen38,39.
Fir Zell Doud an BY-2 Zellen z'entdecken, war en aliquot vun der Zell Suspension mat 0,05% Evans blo fir 10 Minutte bei Raumtemperatur incubated.Selektiv Evans blo Faarwen vun doudege Zellen hänkt vun der Extrusioun vum Faarfstoff aus liewensfäeg Zellen duerch déi intakt Plasma Membran40 of.Faarftéin Zellen sech mat engem helle-Feld microscope observéiert (BX53, Olympus).
HeLa Zellen goufen an DMEM ergänzt mat 10% FBS an engem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C a 5% CO2 ugebaut.Zellen goufen mat 100 μM KAND 11, kumamonamic Seier 6, kumamonamide 1, 100 ng /ml colcemid (Gibco), oder 100 ng /ml Nocodmaze (Sigma) fir 6 h bei 37 ° C behandelt.Zellen goufen mat MetOH fir 10 min fixéiert an duerno mat Acetat fir 5 min bei Raumtemperatur.Fixed Zellen goufen inkubéiert mat β-Tubulin primären Antikörper (1D4A4, Proteintech: 66240-1) verdünnt an 0,5% BSA / PBS fir 2 Stonnen, 3 Mol mat TBST gewäsch, an duerno mat Alexa Fluor Geess Antikörper inkubéiert.488 1h.- Maus IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) an 15 ng / ml 4',6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) verdënntem an 0,5% BSA / PBS.No wäschen mat TBST dräimol, gefierft Zellen goufen op engem Nikon Eclipse Ti-E ëmgedréint Mikroskop observéiert.D'Biller goufen mat enger gekillter Hamamatsu ORCA-R2 CCD Kamera mat MetaMorph Software (Molecular Devices) ageholl.
Post Zäit: Jun-17-2024