Merci fir Äre Besuch op Nature.com. D'Versioun vum Browser, déi Dir benotzt, huet limitéiert CSS-Ënnerstëtzung. Fir déi bescht Resultater empfeelen mir Iech, eng méi nei Versioun vun Ärem Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten). An der Zwëschenzäit, fir déi weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, weisen mir d'Websäit ouni Styling oder JavaScript.
D'Entdeckung an d'benefizitär Notzung vun Naturprodukter kënnen hëllefen, d'Liewe vum Mënsch ze verbesseren. Chemikalien, déi de Planzewuesstum hemmen, gi wäit verbreet als Herbiziden benotzt fir Onkraut ze bekämpfen. Well verschidden Aarte vun Herbiziden gebraucht ginn, ass et néideg, Verbindungen mat neie Wierkungsmechanismen z'identifizéieren. An dëser Studie hu mir eng nei N-Alkoxypyrrolverbindung, Coumamonamid, aus Streptomyces werraensis MK493-CF1 entdeckt an de komplette Syntheseprozess etabléiert. Duerch biologesch Aktivitéitstester hu mir entdeckt, datt urs-Monoaminsäure en syntheteschen Zwëschenprodukt vun urs-Monoamid ass an e potenziellen ...PlanzewuchstehemmerZousätzlech hu mir verschidden Urbenonsäurederivater entwéckelt, dorënner den Urbenyloxyderivat (UDA), deen eng héich herbizid Aktivitéit huet, ouni de Wuesstum vun HeLa-Zellen negativ ze beaflossen. Mir hunn och festgestallt, datt Urbenonsäurederivater Planzemikrotubuli zerstéieren; zousätzlech beaflosst KAND Aktinfilamenter an induzéiert Zelltod; Dës villfälteg Effekter ënnerscheede sech vun deene vu bekannte Mikrotubuli-Inhibitoren a suggeréieren en neie Wierkungsmechanismus fir Ursonsäure, wat e wichtege Virdeel bei der Entwécklung vun neien Herbiziden duerstellt.
D'Entdeckung an d'praktesch Uwendung vu nëtzlechen Naturprodukter an hiren Derivater ass e Mëttel fir d'Liewensqualitéit vum Mënsch ze verbesseren. Sekundär Metabolitten, déi vu Mikroorganismen, Planzen an Insekten produzéiert ginn, hunn zu groussen Fortschrëtter an der Medizin an der Landwirtschaft gefouert. Vill Antibiotike a Medikamenter géint Leukämie goufen aus Naturprodukter entwéckelt. Zousätzlech ginn verschidden Aarte vuPestiziden, Fungiziden an Herbiziden ginn aus dësen Naturprodukter fir den Asaz an der Landwirtschaft extrahéiert. Besonnesch Onkrautbekämpfungsherbiziden sinn wichteg Instrumenter fir d'Ernteerträg an der moderner Landwirtschaft ze erhéijen, a verschidden Aarte vu Verbindungen ginn scho kommerziell benotzt. Verschidde zellulär Prozesser a Planzen, wéi Fotosynthese, Aminosäuremetabolismus, Zellwandsynthese, Reguléierung vun der Mitose, Phytohormonsignalgebung oder Proteinsynthese, gëllen als typesch Ziler vun Herbiziden. Verbindungen, déi d'Mikrotubuli-Funktioun hemmen, sinn eng heefeg Klass vun Herbiziden, déi de Planzewuesstum beaflossen, andeems se d'mitotesch Reguléierung beaflossen.
Mikrotubuli sinn Deeler vum Zytoskelett a si wäit an eukaryoteschen Zellen konservéiert. Den Tubulin-Heterodimer besteet aus α-Tubulin a β-Tubulin a bilden linear Mikrotubuli-Protofilamenter, mat 13 Protofilamenter, déi eng zylindresch Struktur bilden. Mikrotubuli spille verschidde Rollen a Planzenzellen, dorënner d'Bestimmung vun der Zellform, der Zelldeelung an dem intrazelluläre Transport3,4. Planzenzellen enthalen Mikrotubuli ënner der Interphase-Plasmamembran, an et gëtt ugeholl, datt dës sougenannt kortikal Mikrotubuli d'Organisatioun vu Cellulose-Mikrofibrillen duerch d'Reguléierung vu Cellulose-Synthase-Komplexer4,5 kontrolléieren. Kortikal Mikrotubuli vun den Epidermalzellen vun der Wuerzel, déi an der Zon vun der schneller Verlängerung vun der Wuerzelspëtz präsent sinn, si lateral lokaliséiert, an d'Cellulosemikrofibre verfollegen dës Mikrotubuli a limitéieren d'Richtung vun der Zellexpansioun, wouduerch d'anisotrop Zellverlängerung gefördert gëtt. Dofir ass d'Mikrotubuli-Funktioun enk mat der Planzemorphologie verbonnen. Aminosaiersubstitutiounen a Genen, déi Tubulin kodéieren, verursaachen e Verzerrung vu kortikale Mikrotubuli-Arrays a Wuesstum op der lénkser oder rietser Säit bei Arabidopsis 6,7. Ähnlech kënne Mutatiounen a Mikrotubuli-assoziéierte Proteinen, déi d'Mikrotubuli-Dynamik reguléieren, och zu engem verzerrte Wuesstum vum Wuesstum féieren8,9,10,11,12,13. Zousätzlech verursaacht d'Behandlung mat Mikrotubuli-stéierenden Herbiziden, wéi Disopyramid, och bekannt als Pretilachlor, och e schieft Wuesstum vum Wuesstum op der lénkser Säit14. Dës Donnéeën weisen datt eng präzis Reguléierung vun der Mikrotubuli-Funktioun entscheedend ass fir d'Richtung vum Planzewuesstum ze bestëmmen.
Verschidden Aarte vu Mikrotubuli-Inhibitoren goufen entdeckt, an dës Medikamenter hunn e wesentleche Bäitrag zur Zytoskelettfuerschung, souwéi zur Landwirtschaft a Medizin geleescht2. Besonnesch Oryzalin, Dinitroanilinverbindungen, Disopyramid, Benzamid-verwandte Verbindungen an hir Analoga kënnen d'Mikrotubuli-Funktioun hemmen an doduerch de Planzewuesstum hemmen. Dofir gi se wäit verbreet als Herbiziden agesat. Well Mikrotubuli awer eng wichteg Komponent vu Planzen- an Déierezellen sinn, sinn déi meescht Mikrotubuli-Inhibitoren zytotoxesch fir béid Zelltypen. Dofir gëtt, trotz hirem unerkannten Notzen als Herbiziden, eng limitéiert Zuel vun Antimikrotubuli-Agenten fir praktesch Zwecker agesat.
Streptomyces ass eng Gattung aus der Famill Streptomyces, déi aerob, grampositiv, filamentös Bakterien ëmfaasst a wäit bekannt ass fir seng Fäegkeet, eng breet Palette vu sekundäre Metabolitten ze produzéieren. Dofir gëllt et als eng vun de wichtegsten Quelle vun neie biologesch aktive Naturprodukter. An der aktueller Studie hu mir eng nei Verbindung mam Numm Coumamonamid entdeckt, déi aus Streptomyces werraensis MK493-CF1 an S. werraensis ISP 5486 isoléiert gouf. Mat Hëllef vun der Spektralanalyse an der Vollspektralanalyse gouf d'Struktur vum Coumamonamid charakteriséiert a säi eenzegaartegt N-Alkoxypyrrol-Skelett bestëmmt. Ursmonsäure, en syntheteschen Tëscheprodukt vun Ursmonoamid a senge Derivater, huet sech als hemmend fir d'Wuesstum an d'Keimung vun der populärer Modellplanz Arabidopsis thaliana erausgestallt. An enger Struktur-Aktivitéits-Bezéiungsstudie hu mir festgestallt, datt eng Verbindung mat C9, déi zu Ursonsäure modifizéiert ass, genannt Nonyloxy-Derivat vun Ursonsäure (KAND), den hemmenden Effekt op Wuesstum a Keimung däitlech verbessert. Bemerkenswäert ass, datt den nei entdeckten Planzewuesstumshemmer och de Wuesstum vun Tubak a Liewermoss beaflosst huet a net zytotoxesch fir Bakterien oder HeLa-Zellen war. Ausserdeem induzéieren verschidden Urmotonsäurederivater e verzerrte Wuerzelphenotyp, wat implizéiert, datt dës Derivater direkt oder indirekt Mikrotubuli beaflossen. Am Aklang mat dëser Iddi weisen eis Observatioune vu Mikrotubuli, déi entweder immunhistochemesch oder mat fluoreszente Proteinen markéiert sinn, datt d'KAND-Behandlung Mikrotubuli depolymeriséiert. Zousätzlech huet d'Behandlung mat Kumamotonsäurederivater d'Aktin-Mikrofilamenter zerstéiert. Sou hu mir en neie Planzewuesstumshemmer entdeckt, deem säin eenzegaartege Wierkungsmechanismus d'Zerstéierung vum Zytoskelett enthält.
De Stamm MK493-CF1 gouf aus dem Buedem zu Shinagawa-ku, Tokyo, isoléiert. De Stamm MK493-CF1 huet e gutt verzweigt stromalt Myzel geformt. Déi partiell Sequenz vum 16S ribosomal RNA Gen (1422 bp) gouf bestëmmt. Dëse Stamm ass ganz ähnlech wéi S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: typesche Stamm, 99,93%). Baséierend op dësem Resultat gouf festgestallt, datt dëse Stamm enk mam Typstamm vun S. werraensis verwandt ass. Dofir hu mir dëse Stamm provisoresch S. werraensis MK493-CF1 genannt. S. werraensis ISP 5486T produzéiert och déiselwecht bioaktiv Verbindungen. Well et fréi wéineg Fuerschung iwwer d'Auswiel vun natierleche Produkter aus dësem Mikroorganismus gouf, gouf weider chemesch Fuerschung duerchgefouert. Nodeem S. werraensis MK493-CF1 14 Deeg laang op Gerstemedium duerch Festkierperfermentatioun bei 30°C kultivéiert gouf, gouf de Medium mat 50% EtOH extrahéiert. 60 ml vun der Prouf goufen gedréchent fir 59,5 mg Rohextrakt ze kréien. De Rohextrakt gouf enger Reverse-Phase-HPLC ënnerworf fir N-Methoxy-1H-Pyrrol-2-carboxamid (1, genannt Coumamonamid, 36,0 mg) ze kréien. Déi total Quantitéit vun 1 ass ongeféier 60% vum Rohextrakt. Dofir hu mir decidéiert, d'Eegeschafte vum Kumamotoamid 1 am Detail ze studéieren.
Coumamonamid 1 ass e wäisst amorpht Pulver an Héichopléisungsmassespektrometrie (HRESIMS) bestätegt C6H8N2O2 (Fig. 1). De C2-substituéierte Pyrrolfragment vun dëser Verbindung ass charakteriséiert duerch δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH am 1H NMR-Spektrum: 4,5 Hz, H-5) an δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), an den 13C NMR-Spektrum weist d'Präsenz vu véier sp2-Kuelestoffatome. D'Präsenz vun enger Amidgrupp op der C2-Positioun gouf duerch HMBC-Korrelatioun vum C-3-Proton zum Amidcarbonylkuelestoff bei δC 161,1 bewäert. Zousätzlech weisen 1H- an 13C-NMR-Peaken bei δH 4,10 (3H, S) an δC 68,3 op d'Präsenz vun N-Methoxygruppen am Molekül hin. Obwuel déi richteg Positioun vun der Methoxygrupp nach net mat spektroskopescher Analyse wéi Enhanced Difference Spectroscopy an der Nuclear Overhauser Abkürzung (NOEDF) bestëmmt gouf, gouf N-Methoxy-1H-Pyrrol-2-carboxamid déi éischt Kandidatenverbindung.
Fir déi korrekt Struktur vun 1 ze bestëmmen, gouf eng Totalsynthese duerchgefouert (Fig. 2a). D'Behandlung vum kommerziell verfügbaren 2-Aminopyridin 2 mat m-CPBA huet zum entspriechende N-Oxid 3 a quantitativer Ausbezung gefouert. Nom 2-Aminoazidatioun vun 2 gouf d'Zyklokondensatiounsreaktioun, déi vum Abramovich beschriwwe gouf, a Benzol bei 90°C duerchgefouert, fir dat gewënscht 1-Hydroxy-1H-Pyrrol-2-Carbonitril 5 a Gramm ze kréien. Geschwindegkeet 60% (zwee Stufen). 15,16. D'Methyléierung an d'Hydrolyse vu 4 hunn dann 1-Methoxy-1H-Pyrrol-2-Carboxylsäure (bezeechent "Cumotonsäure", 6) a gudder Ausbezung (70%, zwee Schrëtt) ginn. Schlussendlech huet d'Amidatioun iwwer Säurechlorid-Tëscheprodukt 6 mat wässeregem Ammoniak de Kumamoto-Amid 1 an enger Ausbezung vun 98% ginn. All Spektraldaten vum synthetiséierten 1 waren ähnlech wéi déi vum isoléierten 1, sou datt d'Struktur vun 1 bestëmmt gouf;
Allgemeng Synthese an Analyse vun der biologescher Aktivitéit vun Urbenamid an Urbensäure. (a) Total Synthese vu Kumamoto-Amid. (b) Siwe Deeg al Wildtyp-Arabidopsis Columbia (Col) Keimlinger goufen op Murashige a Skoog (MS) Placken ugebaut, déi Coumamonamid 6 oder Coumamonamid 1 an den uginnene Konzentratioune enthalen hunn. Skala = 1 cm.
Fir d'éischt hu mir déi biologesch Aktivitéite vum Urbenamid a senge Zwëschenprodukter op hir Fäegkeet fir de Planzewuesstum ze moduléieren ënnersicht. Mir hunn ënnerschiddlech Konzentratioune vun Ursmonamid 1 oder Ursmonsäure 6 an MS-Agarmedium bäigefüügt an Arabidopsis thaliana Keimlinger op dësem Medium kultivéiert. Dës Tester hunn gewisen, datt héich Konzentratioune (500 μM) vu 6 de Wuerzelwuesstum hemmen (Fig. 2b). Duerno hu mir verschidden Derivater generéiert andeems mir d'N1-Positioun vu 6 ersat hunn a Struktur-Aktivitéit-Bezéiungsstudien op hinnen duerchgefouert (den Analogsyntheseprozess gëtt an den Supporting Information (SI) beschriwwen). Arabidopsis-Keimlinger goufen op engem Medium mat 50 μM Ursonsäurederivater ugebaut, an d'Wuerzellängt gouf gemooss, wéi op der Foto gewisen. Wéi an de Figuren 3a, b an S1 gewisen, hunn Coumamosäuren ënnerschiddlech Längt vu linearen Alkoxyketten (9, 10, 11, 12 an 13) oder grouss Alkoxyketten (15, 16 an 17) op der N1-Positioun. D'Derivater hunn eng bedeitend Hemmung vum Wuerzelwuesstum gewisen. Zousätzlech hu mir festgestallt, datt d'Applikatioun vun 200 μM 10, 11 oder 17 d'Keimung gehemmt huet (Fig. 3c an S2).
Studie vun der Struktur-Aktivitéitsbezéiung vu Kumamoto-Amid a verwandte Verbindungen. (a) Struktur- a Syntheseschema vun Analoga. (b) Quantifizéierung vun der Wuerzellängt vu 7 Deeg ale Keimlinger, déi op MS-Medium mat oder ouni 50 μM Coumamonamidderivater ugebaut goufen. Asterisken weisen signifikant Ënnerscheeder mat der Scheinbehandlung un (t-Test, p< 0,05). n>18. D'Donnéeë ginn als Moyenne ± Standarddeviatioun (SD) ugewisen. nt bedeit "net getest", well méi wéi 50% vun de Somen net gekeimt sinn. (c) Quantifizéierung vun der Keimungsquote vu behandelte Somen, déi 7 Deeg an MS-Medium mat oder ouni 200 μM Coumamonamid a verwandte Verbindungen inkubéiert goufen. Asterisken weisen signifikant Ënnerscheeder mat der Scheinbehandlung (Chi-Quadrat-Test) un. n=96.
Interessanterweis huet d'Zousätzlech vun Alkyl-Säiteketten, déi méi laang wéi C9 sinn, d'inhibitoresch Aktivitéit reduzéiert, wat drop hiweist, datt Verbindungen, déi mat Kumamotsäure verbonne sinn, Säiteketten vun enger bestëmmter Gréisst brauchen, fir hir biologesch Aktivitéit ze weisen.
Well d'Analyse vun der Struktur-Aktivitéit-Bezéiung gewisen huet, datt C9 zu Ursonsäure modifizéiert gouf an den Nonyloxy-Derivat vun Ursonsäure (am weidere weidere als KAND 11 bezeechent) den effektivsten Planzewuesstumshemmer war, hu mir eng méi detailléiert Charakteriséierung vu KAND 11 duerchgefouert. D'Behandlung vun Arabidopsis mat 50 μM KAND 11 huet d'Keimung bal komplett verhënnert, während méi niddreg Konzentratioune (40, 30, 20 oder 10 μM) vu KAND 11 de Wuesstum vun de Wuerzelen dosisofhängeg gehemmt hunn (Fig. 4a, b). Fir ze testen, ob KAND 11 d'Viabilitéit vum Wuerzelmeristem beaflosst, hu mir Wuerzelmeristemen ënnersicht, déi mat Propidiumiodid (PI) gefierft goufen, an d'Gréisst vun der Meristemfläch gemooss. D'Gréisst vum Meristem vu Keimlinger, déi op engem Medium mat 25 μM KAND-11 ugebaut goufen, war 151,1 ± 32,5 μm, während d'Gréisst vum Meristem vu Keimlinger, déi op engem Kontrollmedium mat DMSO ugebaut goufen, 264,7 ± 30,8 μm war (Fig. 4c, d), wat drop hiweist, datt KAND-11 d'zellulär Aktivitéit restauréiert. Verbreedung. Wuerzelmeristem. Am Aklang domat huet d'KAND 11 Behandlung d'Quantitéit vum Zelldeelungsmarker CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS Signal am Wuerzelmeristem reduzéiert (Fig. 4e) 17. Dës Resultater weisen drop hin, datt KAND 11 de Wuerzelwuesstum hemmt andeems en d'Zellproliferatiounsaktivitéit reduzéiert.
Analyse vum hemmenden Effekt vun Urbenonsäurederivaten (Urbenyloxyderivaten) op d'Wuesstum. (a) 7 Deeg al Wildtyp Col Keimlinger, déi op MS-Placken mat den uginnene Konzentratioune vu KAND 11 ugebaut goufen. Skalabalk = 1 cm. (b) Quantifizéierung vun der Wuerzellängt. Buschtawen weisen signifikant Ënnerscheeder un (Tukey HSD Test, p< 0,05). n>16. D'Donnéeë ginn als Moyenne ± Standarddeviatioun (SD) duergestallt. (c) Konfokalmikroskopie vu mat Propidiumiodid gefierfte Wildtyp-Col-Wuerzelen, déi op MS-Placken mat oder ouni 25 μM KAND 11 ugebaut goufen. Wäiss Klammeren weisen d'Wuerzelmeristem un. Skala = 100 µm. (d) Quantifizéierung vun der Gréisst vum Wuerzelmeristem (n = 10 bis 11). Statistesch Ënnerscheeder goufen mat Hëllef vun engem t-Test bestëmmt (p< 0,05). D'Balke representéieren déi duerchschnëttlech Meristemgréisst. (e) Differenzialinterferenzkontrast (DIC) Mikroskopie vun engem Wuerzelmeristem, deen de CDKB2-Konstrukt enthält; 1pro: CDKB2; 1-GUS gefierft a gefierft op 5 Deeg ale Keimlinger, déi op MS-Placken mat oder ouni 25 µM KAND-Assay ugebaut goufen.
D'Phytotoxizitéit vu KAND 11 gouf weider mat enger anerer zäikotyledoner Planz, dem Tubak (Nicotiana tabacum), an engem wichtege Modellorganismus vun enger Landplanz, dem Liewerkraut (Marchantia polymorpha), getest. Wéi am Fall vun Arabidopsis hunn Tubak SR-1 Keimlinger, déi op engem Medium mat 25 μM KAND 11 ugebaut goufen, méi kuerz Wuerzelen produzéiert (Fig. 5a). Zousätzlech sinn 40 vun 48 Somen op Placken mat 200 μM KAND 11 gekimt, während all 48 Somen op simuléierte Medien gekimt sinn, wat drop hiweist, datt méi héich Konzentratioune vu KAND bedeitend waren (p< 0,05; Chi-Test -Quadrat) huet d'Keimung vum Tubak gehemmt. (Fig. 5b). Zousätzlech war d'Konzentratioun vu KAND 11, déi de Bakterienwuesstum am Liewermos gehemmt huet, ähnlech wéi déi effektiv Konzentratioun an Arabidopsis (Fig. 5c). Dës Resultater weisen drop hin, datt KAND 11 de Wuesstum vun enger Villfalt vu Planze hemme kann. Mir hunn duerno déi méiglech Zytotoxizitéit vu Bäremonoamid-verwandte Verbindungen an aneren Organismen ënnersicht, nämlech mënschlech HeLa-Zellen an Escherichia coli-Stamm DH5α, als Vertrieder vun héijer Déier- a Bakterienzellen. An enger Serie vun Zellproliferatiounstester hu mir observéiert, datt Coumamonamid 1, Coumamonamidsäure 6 a KAND 11 de Wuesstum vun HeLa- oder E. coli-Zellen bei Konzentratioune vun 100 μM net beaflosst hunn (Fig. 5d,e).
Wuestumshemmung vu KAND 11 an Net-Arabidopsis Organismen. (a) Zwee Wochen al Wildtyp SR-1 Tubaksseedlings goufen op vertikal positionéierte MS-Placken mat 25 μM KAND 11 ugebaut. (b) Zwee Wochen al Wildtyp SR-1 Tubaksseedlings goufen op horizontal positionéierte MS-Placken mat 200 μM KAND 11 ugebaut. (c) Zwee Wochen al Wildtyp Tak-1 Liewerkrautknospe, déi op Gamborg B5 Placken mat den uginnene Konzentratioune vu KAND 11 ugebaut goufen. Rout Pfeile weisen Sporen un, déi bannent der zwou Wochen Inkubatiounsperiod opgehalen hunn ze wuessen. (d) Zellproliferatiounstest vun HeLa Zellen. D'Zuel vun de liewensfäege Zellen gouf a fixen Zäitintervaller mat engem Zellzielkit 8 (Dojindo) gemooss. Als Kontroll goufen HeLa Zellen mat 5 μg/ml Actinomycin D (Act D) behandelt, wat d'RNA Polymerase Transkriptioun hemmt an Zelltod verursaacht. D'Analysen goufen dräimol duerchgefouert. (e) E. coli Zellproliferatiounstest. E. coli Wuestum gouf duerch Miessung vum OD600 analyséiert. Als Kontroll goufen d'Zellen mat 50 μg/ml Ampicillin (Amp) behandelt, wat d'Synthese vun der bakterieller Zellwand hemmt. D'Analysen goufen dräimol duerchgefouert.
Fir de Wierkungsmechanismus vun der Zytotoxizitéit, déi duerch Uramid-verwandte Verbindungen verursaacht gëtt, ze entschlësselen, hu mir Urbensäurederivater mat mëttelméissegen inhibitoreschen Effekter nei analyséiert, wéi op der Foto gewisen. Wéi an de Figuren 2b, 6a gewisen, hunn d'Séimlinger, déi op Agarplacke mat héije Konzentratioune (200 μM) Urmotonsäure 6 ugebaut goufen, méi kuerz a lénks gebéit Wuerzelen produzéiert (θ = – 23,7 ± 6,1), während bei de Séimlinger, déi um Kontrollmedium ugebaut goufen, d'Séimlinger bal riicht Wuerzelen produzéiert hunn (θ = – 3,8 ± 7,1). Dëst charakteristescht schieft Wuesstum ass bekanntlech duerch eng Dysfunktioun vu kortikale Mikrotubuli resultéieren14,18. Am Aklang mat dësem Befund hunn déi mikrotubuli-destabiliséierend Medikamenter Disopyramid an Oryzalin eng ähnlech Wuesstumskippung ënner eise Wuesstumsbedingungen induzéiert (Fig. 2b, 6a). Gläichzäiteg hu mir Urmotonsäurederivater getest a verschidde vun hinnen ausgewielt, déi a bestëmmte Konzentratioune schieft Wuerzelwuesstum induzéiert hunn. D'Verbindungen 8, 9 an 15 hunn d'Richtung vum Wuesstum vun de Wuerzelen bei 75 μM, 50 μM respektiv 40 μM geännert, wat drop hiweist, datt dës Verbindungen effektiv Mikrotubuli destabiliséiere kënnen (Fig. 2b, 6a). Mir hunn och dat potentst Ursolsäurederivat, KAND 11, bei enger méi niddreger Konzentratioun (15 μM) getest a festgestallt, datt d'Applikatioun vu KAND 11 de Wuesstum vun de Wuerzelen hemmt an datt d'Richtung vum Wuesstum vun de Wuerzelen ongläichméisseg war, obwuel se no lénks geneigt waren (Figur C3). Well méi héich Konzentratioune vu Mikrotubuli-destabiliséierende Medikamenter heiansdo de Planzewuesstum hemmen anstatt d'Wuerzelkippung ze verursaachen, hu mir duerno d'Méiglechkeet ënnersicht, datt KAND 11 d'Mikrotubuli beaflosst, andeems mir kortikale Mikrotubuli an den epidermalen Zellen vun de Wuerzelen observéiert hunn. Immunhistochemie mat Anti-β-Tubulin-Antikörper an epidermalen Zellen vu Keimlingswuerzelen, déi mat 25 μM KAND 11 behandelt goufen, huet d'Verschwanne vu bal all kortikale Mikrotubuli an den epidermalen Zellen an der Elongatiounszon gewisen (Fig. 6b). Dës Resultater weisen drop hin, datt Kumamotonsäure an hir Derivater direkt oder indirekt op Mikrotubuli wierken, fir se ze zerstéieren, an datt dës Verbindungen nei Mikrotubuli-Inhibitoren sinn.
Ursonsäure a seng Derivater veränneren d'kortikal Mikrotubuli an Arabidopsis thaliana. (a) Wuerzelinklinatiounswénkel gemooss a Präsenz vu verschiddenen Urmonsäurederivater bei den uginnene Konzentratioune. D'Effekter vun zwou Verbindungen, déi bekannt sinn, fir Mikrotubuli ze hemmen: Disopyramid an Oryzalin, goufen och analyséiert. Den Asaz weist de Standard, deen benotzt gëtt fir de Wuerzelwuesstumswénkel ze moossen. Asterisken weisen signifikant Ënnerscheeder mat der Scheinbehandlung un (t-Test, p< 0,05). n>19. Skalabalk = 1 cm. (b) Kortikal Mikrotubuli an epidermalen Zellen an der Elongatiounszon. Mikrotubuli a Wildtyp Arabidopsis Col Wuerzelen, déi op MS Placken mat oder ouni 25 μM KAND 11 gewuess sinn, goufen duerch immunhistochemesch Färbung mat β-Tubulin primären Antikörper an Alexa Fluor-konjugéierten sekundären Antikörper visualiséiert. Skalabalk = 10 µm. (c) Mitotesch Struktur vu Mikrotubuli am Wuerzelmeristem. Mikrotubuli goufen duerch immunhistochemesch Färbung visualiséiert. Mitotesch Strukturen, dorënner Prophasezonen, Spindelen a Phragmoplasten, goufen aus konfokale Biller gezielt. Pfeiler weisen mitotesch Mikrotubulistrukturen un. Asterisken weisen signifikant Ënnerscheeder mat der Scheinbehandlung un (t-Test, p< 0,05). n>9. Skalabalk = 50 µm.
Obwuel Ursa d'Fäegkeet huet, d'Mikrotubuli-Funktioun ze stéieren, gëtt erwaart, datt säi Wierkungsmechanismus anescht ass wéi dat vun typesche Mikrotubuli-Depolymerisatiounsmëttelen. Zum Beispill induzéieren méi héich Konzentratioune vu Mikrotubuli-Depolymerisatiounsmëttelen, wéi Disopyramid an Oryzalin, eng anisotrop Expansioun vun Epidermalzellen, während KAND 11 dat net mécht. Zousätzlech huet d'gläichzäiteg Uwendung vu KAND 11 an Disopyramid zu enger kombinéierter Disopyramid-induzéierter Wuesstumsreaktioun gefouert, an et gouf eng KAND 11-induzéiert Wuesstumshemmung observéiert (Fig. S4). Mir hunn och d'Reaktioun vum hypersensiblen Disopyramid 1-1 (phs1-1) Mutant op KAND 11 analyséiert. phs1-1 huet eng net-kanonesch Tubulin-Kinase-Punktmutatioun a produzéiert méi kuerz Wuerzelen, wann et mat Disopyramid behandelt gëtt9,20. phs1-1 Mutant-Séimlinger, déi op Agarmedium mat KAND 11 ugebaut goufen, haten méi kuerz Wuerzelen, ähnlech wéi déi, déi op Disopyramid ugebaut goufen (Fig. S5).
Zousätzlech hu mir mitotesch Mikrotubuli-Strukturen, wéi Prophasezonen, Spindelen a Phragmoplasten, am Wuerzelmeristem vu Keimlinger observéiert, déi mat KAND 11 behandelt goufen. Am Aklang mat den Observatioune fir CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS gouf eng bedeitend Ofsenkung vun der Zuel vu mitotesche Mikrotubuli observéiert (Fig. .6c).
Fir d'Zytotoxizitéit vu KAND 11 bei subzellulärer Opléisung ze charakteriséieren, hu mir Tubaks-BY-2-Suspensionszellen mat KAND 11 behandelt an hir Äntwert observéiert. Mir hunn als éischt KAND 11 zu BY-2-Zellen bäigefüügt, déi TagRFP-TUA6 expriméieren, wat Mikrotubuli fluoreszent markéiert, fir den Effekt vu KAND 11 op kortikale Mikrotubuli ze bewäerten. D'kortikale Mikrotubuli-Dicht gouf mat Hëllef vun enger Bildanalyse bewäert, déi de Prozentsaz vun den Zytoskelettpixelen ënner de zytoplasmatesche Pixel quantifizéiert huet. D'Assayresultater hunn gewisen, datt no der Behandlung mat 50 μM oder 100 μM KAND 11 fir 1 Stonn d'Dicht signifikant op 0,94 ± 0,74% respektiv 0,23 ± 0,28% erofgaangen ass, während d'Dicht vun den Zellen, déi mat DMSO behandelt goufen, 1,61 ± 0,34% belaf huet (Fig. 7a). Dës Resultater stëmmen mat der Observatioun an Arabidopsis iwwereneen, datt d'KAND 11-Behandlung d'Depolymeriséierung vu kortikale Mikrotubuli induzéiert (Fig. 6b). Mir hunn och d'BY-2 Linn mat GFP-ABD-markéierten Aktinfilamenter no der Behandlung mat der selwechter Konzentratioun vu KAND 11 ënnersicht a festgestallt, datt d'KAND 11 Behandlung d'Aktinfilamenter zerstéiert huet. D'Behandlung mat 50 μM oder 100 μM KAND 11 fir 1 Stonn huet d'Aktinfilamentdicht signifikant op 1,20 ± 0,62% respektiv 0,61 ± 0,26% reduzéiert, während d'Dicht an DMSO-behandelten Zellen 1,69 ± 0,51% war (Fig. 2). 7b). Dës Resultater kontrastéieren mat den Effekter vu Propyzamid, wat d'Aktinfilamenter net beaflosst, a Latrunculin B, engem Aktin-Depolymerisator, deen d'Mikrotubuli net beaflosst (SI Figur S6). Zousätzlech huet d'Behandlung mat Coumamonamid 1, Coumamonamidsäure 6 oder KAND 11 d'Mikrotubuli an HeLa-Zellen net beaflosst (SI Figur S7). Dofir gëtt ugeholl, datt de Wierkungsmechanismus vu KAND 11 anescht ass wéi dee vu bekannte Zytoskelett-Stéierer. Zousätzlech huet eis mikroskopesch Observatioun vu BY-2 Zellen, déi mat KAND 11 behandelt goufen, den Ufank vum Zelltod während der KAND 11 Behandlung opgedeckt an huet gewisen, datt den Undeel vun den Evans-blo-gefierften doudegen Zellen no 30 Minutte KAND 11 Behandlung net signifikant eropgaangen ass, während no 90 Minutte Behandlung mat 50 μM oder 100 μM KAND d'Zuel vun den doudegen Zellen op 43,7% respektiv 80,1% eropgaangen ass (Fig. 7c). Zesummegeholl weisen dës Donnéeën drop hin, datt den neien Ursolsäurederivat KAND 11 e planzespezifesche Zytoskelett-Inhibitor mat engem bis elo onbekannte Wierkungsmechanismus ass.
KAND beaflosst kortikale Mikrotubuli, Aktinfilamenter an d'Viabilitéit vun Tubaks-BY-2-Zellen. (a) Visualiséierung vu kortikale Mikrotubuli a BY-2-Zellen a Präsenz vun TagRFP-TUA6. BY-2-Zellen, déi mat KAND 11 (50 μM oder 100 μM) oder DMSO behandelt goufen, goufen duerch konfokal Mikroskopie ënnersicht. D'Dicht vun der kortikaler Mikrotubuli gouf aus Mikroskopië vun 25 onofhängege Zellen berechent. Buschtawen weisen signifikant Ënnerscheeder un (Tukey HSD-Test, p< 0,05). Skalabalk = 10 µm. (b) Kortikale Aktinfilamenter a BY-2 Zellen, déi a Präsenz vu GFP-ABD2 visualiséiert goufen. BY-2 Zellen, déi mat KAND 11 (50 μM oder 100 μM) oder DMSO behandelt goufen, goufen duerch konfokal Mikroskopie ënnersicht. D'Dicht vun de kortikale Aktinfilamenter gouf aus Mikroskopië vun 25 onofhängege Zellen berechent. Buschtawen weisen signifikant Ënnerscheeder un (Tukey HSD Test, p< 0,05). Skalabalk = 10 µm. (c) Observatioun vun doudegen BY-2 Zellen duerch Evans-Blo-Färbung. BY-2 Zellen, déi mat KAND 11 (50 μM oder 100 μM) oder DMSO behandelt goufen, goufen duerch Hellfeldmikroskopie ënnersicht. n=3. Skalabalk = 100 µm.
D'Entdeckung an d'Uwendung vun neien Naturprodukter huet zu bedeitende Fortschrëtter a verschiddenen Aspekter vum mënschleche Liewen gefouert, dorënner Medizin a Landwirtschaft. Historesch Fuerschung gouf duerchgefouert fir nëtzlech Verbindungen aus natierleche Ressourcen ze kréien. Besonnesch Aktinomyceten si bekannt als nëtzlech als antiparasitär Antibiotike fir Nematoden wéinst hirer Fäegkeet fir verschidde sekundär Metabolitte wéi Avermectin ze produzéieren, déi féierend Verbindung vun Ivermectin a Bleomycin a senge Derivater, déi medizinesch als Antikriibsmëttel benotzt ginn21,22. Och eng Vielfalt vun herbiziden Verbindungen goufen aus Aktinomyceten entdeckt, vun deenen e puer scho kommerziell benotzt ginn1,23. Dofir gëllt d'Analyse vun Aktinomyceten-Metabolitte fir Naturprodukter mat gewënschten biologeschen Aktivitéiten ze isoléieren als eng effektiv Strategie. An dëser Studie hu mir eng nei Verbindung, Coumamonamid, aus S. werraensis entdeckt a se erfollegräich synthetiséiert. Ursonsäure ass en syntheteschen Zwëschenprodukt vun Urbenamid a senge Derivater. Si kann charakteristesch Wuerzelkrullung verursaachen, moderéiert bis staark herbizid Aktivitéit weisen a Planzemikrotubuli direkt oder indirekt beschiedegen. Wéi och ëmmer, de Wierkungsmechanismus vun Urmotonsäure kann sech vun deem vun existente Mikrotubuli-Inhibitoren ënnerscheeden, well KAND 11 och Aktinfilamenter zerstéiert an Zelltod verursaacht, wat op e Reguléierungsmechanismus hiweist, duerch deen Urmotonsäure an hir Derivater eng breet Palette vu Zytoskelettstrukturen beaflossen.
Eng weider detailléiert Charakteriséierung vun der Ursonsäure hëlleft, de Wierkungsmechanismus vun der Urbenonsäure besser ze verstoen. Besonnesch dat nächst Zil ass et, d'Fäegkeet vun der Ursonsäure ze evaluéieren, sech un reduzéiert Mikrotubuli ze bannen, fir ze bestëmmen, ob d'Ursonsäure an hir Derivater direkt op d'Mikrotubuli wierken an se depolymeriséieren, oder ob hir Wierkung zu enger Destabiliséierung vun de Mikrotubuli féiert. Zousätzlech, am Fall wou Mikrotubuli keen direkten Zil sinn, hëlleft d'Identifikatioun vum Wierkungsplaz an de molekulare Ziler vun der Ursonsäure op Planzenzellen, d'Eegeschafte vu verwandte Verbindungen a méiglech Weeër fir d'herbizid Aktivitéit ze verbesseren, weider ze verstoen. Eise Bioaktivitéitsassay huet déi eenzegaarteg zytotoxesch Fäegkeet vun der Ursonsäure um Wuesstum vu Planzen wéi Arabidopsis thaliana, Tubak a Liewermos opgedeckt, während weder E. coli nach HeLa-Zellen betraff waren. Wéineg oder keng Toxizitéit fir Déierzellen ass e Virdeel vun der Ursonsäurederivater, wa se als Herbiziden fir d'Benotzung an oppene landwirtschaftleche Felder entwéckelt ginn. Tatsächlech, well Mikrotubuli heefeg Strukturen an Eukaryoten sinn, ass hir selektiv Hemmung a Planzen eng Schlësselviraussetzung fir Herbiziden. Zum Beispill gëtt Propyzamid, e Mikrotubuli-Depolymerisatiounsmëttel, dat direkt un Tubulin bindt an d'Polymeriséierung hemmt, als Herbizid benotzt wéinst senger gerénger Toxizitéit fir Déierzellen24. Am Géigesaz zu Disopyramid hunn verwandte Benzamiden aner Zilspezifizitéiten. Nieft Planzemikrotubuli hemmt RH-4032 oder Benzoxamid och Mikrotubuli vun Déierzellen oder Oomyceten, a Zalilamid gëtt als Fungizid benotzt wéinst senger gerénger Phytotoxizitéit25,26,27. De nei entdeckte Bier a seng Derivater weisen selektiv Zytotoxizitéit géint Planzen op, awer et ass derwäert ze bemierken, datt weider Modifikatioune hir Zilspezifizitéit änneren kënnen, wat potenziell zousätzlech Derivater fir d'Kontroll vu pathogene Pilze oder Oomyceten liwwere kann.
Déi eenzegaarteg Eegeschafte vun Urbenonsäure a senge Derivater si nëtzlech fir hir Entwécklung als Herbiziden a fir d'Benotzung als Fuerschungsinstrumenter. D'Wichtegkeet vum Zytoskelett bei der Kontroll vun der Form vu Planzenzellen ass wäit unerkannt. Fréier Studien hunn gewisen, datt Planzen komplex Mechanismen vun der kortikaler Mikrotubuli-Organisatioun entwéckelt hunn, andeems se d'Mikrotubuli-Dynamik kontrolléiert hunn, fir d'Morphogenese richteg ze kontrolléieren. Eng grouss Zuel vu Molekülen, déi fir d'Reguléierung vun der Mikrotubuli-Aktivitéit verantwortlech sinn, goufen identifizéiert, a verwandte Fuerschung ass nach ëmmer amgaang3,4,28. Eist aktuellt Verständnis vun der Mikrotubuli-Dynamik a Planzenzellen erkläert d'Mechanismen vun der kortikaler Mikrotubuli-Organisatioun net vollstänneg. Zum Beispill, obwuel souwuel Disopyramid wéi och Oryzalin Mikrotubuli depolymeriséiere kënnen, verursaacht Disopyramid eng schwéier Wuerzelverzerrung, während Oryzalin e relativ mëllen Effekt huet. Ausserdeem verursaache Mutatiounen am Tubulin, wat Mikrotubuli stabiliséiert, och Dextrorotatioun an de Wuerzelen, während Paclitaxel, wat och d'Mikrotubuli-Dynamik stabiliséiert, dat net mécht. Dofir sollt d'Studie an d'Identifikatioun vun de molekulare Ziler vun der Ursolsäure nei Abléck an d'Reguléierung vu planzekortikale Mikrotubuli liwweren. Och zukünfteg Vergläicher vu Chemikalien, déi effektiv sinn fir e verzerrt Wuesstum ze fërderen, wéi zum Beispill Disopyramid, a manner effektive Chemikalien, wéi Oryzalin oder Kumamotorsäure, wäerten Hiweiser drop liwweren, wéi e verzerrt Wuesstum geschitt.
Op der anerer Säit sinn ofwierbezunnen Zytoskelett-Ëmlagerungen eng aner Méiglechkeet fir d'Zytotoxizitéit vun Ursonsäure z'erklären. Infektioun vun engem Pathogen oder d'Aféierung vun engem Elikitor a Planzenzellen verursaacht heiansdo d'Zerstéierung vum Zytoskelett an en uschléissenden Zelltod29. Zum Beispill gouf bericht, datt Oomycet-ofgeleet Kryptoxanthin Mikrotubuli an Aktinfilamenter virum Tubakszelltod zerstéiert, ähnlech wéi bei der KAND-Behandlung30,31. D'Ähnlechkeeten tëscht Ofwierreaktiounen an zelluläre Reaktiounen, déi duerch Ursonsäure induzéiert ginn, hunn eis zur Hypothes gefouert, datt si gemeinsam zellulär Prozesser ausléisen, obwuel e méi schnelle a méi staarke Effekt vun Ursonsäure wéi Kryptoxanthin evident ass. Studien hunn awer gewisen, datt d'Stéierung vun Aktinfilamenter spontanen Zelltod fördert, deen net ëmmer vun enger Mikrotubuli-Stéierung begleet gëtt29. Zousätzlech bleift ofzewaarden, ob entweder de Pathogen oder den Elikitor verzerrt Wuerzelwuesstum verursaacht, wéi Ursonsäurederivater et maachen. Dofir ass molekulares Wëssen, dat Ofwierreaktiounen an dem Zytoskelett verbënnt, e attraktivt Problem, dat ugepaakt muss ginn. Indem si d'Präsenz vu Verbindungen mat nidderegem Molekulargewiicht, déi mat Ursonsäure verbonne sinn, souwéi eng Rei vun Derivater mat ënnerschiddlecher Potenz ausnotzen, kënne si Méiglechkeeten ubidden, fir onbekannt zellulär Mechanismen unzespriechen.
Zesummegefaasst wäert d'Entdeckung an d'Uwendung vun neie Verbindungen, déi d'Dynamik vun de Mikrotubuli moduléieren, mächteg Methoden ubidden, fir déi komplex molekulare Mechanismen unzegoen, déi der Formbestëmmung vu Planzenzellen zugrond leien. An dësem Kontext kéint déi kierzlech entwéckelt Verbindung Urmotonsäure, déi Mikrotubuli an Aktinfilamenter beaflosst an Zelltod induzéiert, eng Méiglechkeet bidden, den Zesummenhang tëscht der Kontroll vun de Mikrotubuli an dësen anere Mechanismen ze entschlësselen. Dofir wäerten eis chemesch a biologesch Analysen mat Urbenonsäure hëllefen, déi molekular Reguléierungsmechanismen ze verstoen, déi de Planzenzytoskelett kontrolléieren.
Impft S. werraensis MK493-CF1 an en 500 ml Erlenmeyer-Kolben mat Schalldämpfer, deen 110 ml Sommedium enthält, dat aus 2% (w/v) Galaktose, 2% (w/v) Essenzpaste, 1% (w/v) Bacto-Zesummesetzung besteet. -Soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) Maisextrakt (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 an 0,2% CaCO3 an deioniséiertem Waasser besteet. (pH 7,4 virun der Sterilisatioun). D'Somkulturen goufen 2 Deeg laang op engem Rotatiounsschütter (180 rpm) bei 27°C inkubéiert. Produktiounskultivatioun iwwer Festkierperfermentatioun. D'Saatkultur (7 ml) gouf an e 500 ml K-1 Kolben transferéiert, deen 40 g Produktiounsmedium enthält, bestehend aus 15 g gepresster Gerste (MUSO Co., Ltd., Japan) an 25 g deioniséiertem Waasser (pH-Wäert net virun der Sterilisatioun ugepasst). D'Fermentatioun gouf 14 Deeg bei 30 °C am Däischteren duerchgefouert. D'Fermentatiounsmaterial gouf mat 40 ml EtOH/Fläsch extrahéiert an zentrifugéiert (1500 g, 4 °C, 10 Minutten). Den Kultursupernatant (60 ml) gouf mat enger Mëschung aus 10% MeOH/EtOAc extrahéiert. Déi organesch Schicht gouf ënner reduzéiertem Drock verdampft fir e Rescht (59,5 mg) ze kréien, deen enger HPLC mat Gradientelutioun (0–10 Minutten: 90%) op enger Réckphas-Sail (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × Längt 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 Minutten: 90% H2O/CH3CN op 70% H2O/CH3CN (Gradient), 35–45 Minutten: 90% H2O/EtOH, 45–155 Minutten: 90% H2O/EtOH op 100% EtOH (Gradient (Gradient), 155–200 min: 100% EtOH) mat enger Duerchflussrate vun 1,5 ml/min ënnerworf gouf, Coumamonamid (1, 36,0 mg) gouf als wäisst amorft Pulver isoléiert.
Kumamotoamid(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz, 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ berechent Wäert: 141.0659, gemoosse Wäert: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Columbia-Somen (Col-0) goufe vum Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) mat Erlaabnes fir d'Fuerschung kritt. Col-0-Somen goufen ënner eise Laborbedingungen propagéiert a gepflegt a als Wildtyp-Arabidopsis-Planzen benotzt. Arabidopsis-Somen goufen Uewerflächensteriliséiert a kultivéiert an engem halleffeste Murashige- a Skoog-Medium mat 2% Saccharose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morpholino)ethansulfonsäure (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) an 1,5% Agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, bei 23 °C a konstantem Liicht. D'Somen vum phs1-1-Mutant goufe vum T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) zur Verfügung gestallt.
D'Somen vum Stamm SR-1 goufe vum T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) geliwwert a goufen als Wildtyp-Tubaksplanzen benotzt. D'Tubakssomen goufen Uewerflächensteriliséiert an dräi Nuechten a sterilem Waasser ageweit fir d'Keimung ze fërderen, duerno an eng hallefkonzentréiert Léisung mat 2% Saccharose, 0,05% (w/v) MES an 0,8% Gellangummi (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. a Skoog Medium) mat pH 5,7 placéiert an bei 23°C ënner konstantem Liicht inkubéiert.
De Stamm Tak-1 gouf vum T. Kohchi (Universitéit vu Kyoto) zur Verfügung gestallt a gouf als Standard-Experimentunitéit fir d'Liewermossstudie benotzt. Gemma gouf aus steriliséierte kultivéierte Planzen gewonnen an duerno op Gamborg B5 Medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) mat 1% Saccharose an 0,3% Gellangummi ausgeplatt an bei 23°C ënner kontinuéierlechem Liicht inkubéiert.
Tubak BY-2 Zellen (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) goufe vum S. Hasezawa (Universitéit vun Tokyo) zur Verfügung gestallt. BY-2 Zellen goufen 95-fach a modifizéiertem Linsmeier a Skoog Medium verdënnt a wöchentlech mat 2,4-Dichlorophenoxyessigsäure 32 ergänzt. D'Zellsuspensioun gouf op engem Rotatiounsschütter mat 130 rpm bei 27°C am Däischteren gemëscht. Zellen mat dem 10-fache Volumen vu frëschem Medium wäschen a resuspendéieren am selwechte Medium. BY-2 transgen Zellkulturen, déi stabil de Mikrotubulusmarker TagRFP-TUA6 oder den Aktinfilamentmarker GFP-ABD2 ënner dem Blummenkohlmosaikvirus 35S Promotor expriméieren, goufen wéi beschriwwen 33,34,35 generéiert. Dës Zellkulturen kënnen ënnerhale a synchroniséiert ginn mat Prozeduren ähnlech wéi déi, déi fir déi ursprénglech BY-2 Zellkultur benotzt goufen.
HeLa-Zellen goufen an Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) (Life Technologies) ergänzt mat 10% fetaltem Rinderserum, 1,2 U/ml Penicillin an 1,2 μg/ml Streptomycin an engem 37°C Inkubator mat 5% CO2 kultivéiert.
All Experimenter, déi an dësem Manuskript beschriwwe ginn, goufen am Aklang mat de japanesche Biosécherheetsreglementer a Richtlinne duerchgefouert.
D'Verbindunge goufen an Dimethylsulfoxid (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) als Stammléisungen opgeléist a verdënnt an MS-Medium fir Arabidopsis an Tubak oder Gamborg B5-Medium fir Liewermos. Fir den Wuesstumshemmungstest goufen méi wéi 10 Somen pro Teller op Agarmedium mat den uginnene Verbindungen oder DMSO geséit. D'Somen goufen 7 Deeg an enger Wuesskammer inkubéiert. D'Séimlinger goufe fotograféiert an d'Längt vun de Wuerzele gemooss. Fir den Arabidopsis-Keimungstest goufen 48 Somen pro Teller op Agarmedium mat 200 μM Verbindung oder DMSO geséit. Arabidopsis-Somen goufen an enger Wuesskammer ugebaut an d'Zuel vun de gekeimte Séimlinger gouf 7 Deeg no der Keimung (dag) gezielt. Fir den Tubaks-Keimungstest goufen 24 Somen pro Teller op Agarmedium mat 200 μM KAND oder DMSO geséit. Tubakssomen goufen an enger Wuesskammer ugebaut an d'Zuel vun de gekeimte Séimlinger gouf no 14 Deeg gezielt. Fir den Assay iwwer d'Wuestumshemmung vum Liewermos goufen 9 Embryonen aus all Placke op Agarmedium mat den uginnene Konzentratioune vu KAND oder DMSO ausgeplatt an 14 Deeg an enger Wuestumskammer inkubéiert.
Benotzt Keimlinger, déi mat 5 mg/ml Propidiumiodid (PI) gefierft goufen, fir d'Organisatioun vum Wuerzelmeristem ze visualiséieren. PI-Signaler goufen duerch Fluoreszenzmikroskopie mat engem TCS SPE konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (Leica Microsystems) observéiert.
Histochemesch Färbung vu Wuerzelen mat β-Glucuronidase (GUS) gouf no dem Protokoll vum Malami a Benfey36 duerchgefouert. D'Setzlinger goufen iwwer Nuecht an 90% Aceton fixéiert, mat 0,5 mg/ml 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-d-Glucuronsäure a GUS-Puffer fir 1 Stonn gefierft an an eng hydratiséiert Chloraldehydléisung (8 g Chloralhydrat, 2 ml Waasser an 1 ml Glycerol) geluecht an duerch Differenzialinterferenzkontrastmikroskopie mat engem Axio Imager M1 Mikroskop (Carl Zeiss) observéiert.
D'Wénkele vun de Wuerzele goufen op 7 Deeg ale Keimlinger gemooss, déi op vertikal placéierte Placke gewuess sinn. Mooss de Wénkel vun der Wuerzel aus der Richtung vum Schwéierkraaftvektor wéi a Schrëtt 6 beschriwwen.
D'Anordnung vun de kortikale Mikrotubuli gouf wéi beschriwwen observéiert, mat klenge Modifikatiounen um Protokoll 37. Anti-β-Tubulin-Antikörper (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) an Alexa Fluor 488-konjugéiert Anti-Maus-IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) goufen als primär an sekundär Antikörper a Verdënnungen 1:1000 respektiv 1:100 benotzt. Fluoreszenzbiller goufen mat engem TCS SPE konfokale Laser-Scanning-Mikroskop (Leica Microsystems) opgeholl. Z-Stack-Biller ophuelen a Projektioune mat maximaler Intensitéit no den Instruktioune vum Hiersteller erstellen.
Den HeLa-Zellproliferatiounsassay gouf mat dem Cell Counting Kit 8 (Dojindo) no den Instruktioune vum Hiersteller duerchgefouert.
D'Wuesstum vun E. coli DH5α gouf analyséiert andeems d'Zelldicht an der Kultur mat engem Spektrophotometer bei 600 nm (OD600) gemooss gouf.
D'Zytoskelettorganisatioun an transgenen BY-2 Zellen gouf mat engem Fluoreszenzmikroskop observéiert, dat mat engem CSU-X1 konfokalen Scanapparat (Yokogawa) an enger sCMOS Kamera (Zyla, Andor Technology) ausgestatt war. D'Zytoskelettdicht gouf duerch Bildanalyse bewäert, déi de Prozentsaz vun den Zytoskelettpixelen ënner de zytoplasmatesche Pixelen a konfokale Biller mat der ImageJ Software quantifizéiert huet, wéi beschriwwen38,39.
Fir den Zelltod an BY-2 Zellen z'entdecken, gouf en Aliquot vun der Zellsuspensioun mat 0,05% Evans-Blo fir 10 Minutten bei Raumtemperatur inkubéiert. Selektiv Evans-Blo-Färbung vun doudegen Zellen hänkt vun der Extrusioun vum Faarfstoff aus liewensfäege Zellen duerch déi intakt Plasmamembran of40. Gefierft Zellen goufen mat engem Hellfeldmikroskop (BX53, Olympus) observéiert.
HeLa-Zellen goufen an DMEM ergänzt mat 10% FBS an engem befeuchteten Inkubator bei 37°C a 5% CO2 ugebaut. D'Zellen goufen 6 Stonnen bei 37°C mat 100 μM KAND 11, Kumamonaminsäure 6, Kumamonamid 1, 100 ng/ml Colcemid (Gibco) oder 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) behandelt. D'Zellen goufen 10 Minutte mat MetOH an duerno 5 Minutte mat Acetat bei Raumtemperatur fixéiert. Fixéiert Zellen goufen 2 Stonnen mat engem primäre β-Tubulin-Antikörper (1D4A4, Proteintech: 66240-1) inkubéiert, verdënnt an 0,5% BSA/PBS, 3 Mol mat TBST gewäsch an duerno mat engem Geesseantikörper Alexa Fluor inkubéiert. 488 1 Stonn. – Maus-IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) an 15 ng/ml 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) verdënnt an 0,5% BSA/PBS. Nom dräimol Wäsche mat TBST goufen gefierft Zellen op engem invertéierte Nikon Eclipse Ti-E Mikroskop observéiert. Biller goufe mat enger ofgekillter Hamamatsu ORCA-R2 CCD Kamera mat der MetaMorph Software (Molecular Devices) opgeholl.
Zäitpunkt vun der Verëffentlechung: 17. Juni 2024