Shoot apical Meristem (SAM) Wuesstum ass kritesch fir Stammarchitektur. Planz Hormonengibberellins(GAs) spillen Schlësselrollen bei der Koordinatioun vu Planzenwuesstum, awer hir Roll am SAM bleift schlecht verstanen. Hei hu mir e ratiometresche Biosensor vu GA Signaliséierung entwéckelt andeems d'DELLA Protein entwéckelt fir seng wesentlech Reguléierungsfunktioun an der GA Transkriptiounsreaktioun z'ënnerdrécken, wärend seng Degradatioun op GA Unerkennung behalen. Mir weisen datt dësen Degradatiounsbaséierte Biosensor präzis Ännerungen am GA Niveauen an der cellulärer Sensing wärend der Entwécklung notéiert. Mir hunn dëse Biosensor benotzt fir GA Signalaktivitéit am SAM ze kartéieren. Mir weisen datt héich GA Signaler haaptsächlech an Zellen präsent sinn, déi tëscht Uergel Primordia sinn, déi Virgänger fir internode Zellen sinn. Mat Gewënn- a Verloscht-vun-Funktioun Approche beweise mir weider datt GA d'Orientéierung vum Zell Divisiounsplang reguléiert, déi kanonesch cellulär Organisatioun vun Internoden opzebauen, an doduerch d'Internode Spezifizéierung am SAM förderen.
De Schéiss apical Meristem (SAM), deen um Schéissspëtz läit, enthält eng Nisch vu Stammzellen, deenen hir Aktivitéit lateral Organer a Stammknäppchen op eng modulär an iterativ Manéier am ganze Liewen vun der Planz generéiert. Jiddereng vun dësen Widderhuelungseenheeten, oder Planzeknäppchen, enthält Internoden a lateral Organer an de Wirbelen, an axillär Meristeme an de Blataxillen1. De Wuesstum an d'Organisatioun vun de Planzennoden ännert sech während der Entwécklung. An Arabidopsis gëtt den internodale Wuesstum während der vegetativer Etapp ënnerdréckt, an axillär Meristems bleiwen an den Axillen vun de Rosetteblieder dormant. Wärend dem Iwwergank an d'Blummenphase gëtt de SAM d'Bléiungsmeristem, generéiert verlängert Internoden an Axilläre Knospe, Branchen an den Axillen vun de Kaulineblieder, a spéider blatlos Blummen2. Och wa mir bedeitend Fortschrëtter gemaach hunn fir d'Mechanismen ze verstoen, déi d'Initiatioun vu Blieder, Blummen a Branchen kontrolléieren, ass relativ wéineg bekannt iwwer wéi Internoden entstinn.
Verständnis vun der spatiotemporaler Verdeelung vu GAs hëlleft d'Funktioune vun dësen Hormonen a verschiddene Stoffer a verschiddene Entwécklungsstadien besser ze verstoen. Visualiséierung vun der Degradatioun vun der RGA-GFP Fusioun ausgedréckt ënner der Handlung vu sengem eegene Promoteur liwwert wichteg Informatioun iwwer d'Reguléierung vun den Total GA Niveauen an roots15,16. Wéi och ëmmer, RGA Ausdrock variéiert iwwer Stoffer17 a gëtt vum GA18 geregelt. Also, differentiell Ausdrock vun der RGA Promoteur kann zu der fluorescence Muster observéiert mat RGA-GFP Resultat an esou ass dës Method net quantitativ. Méi kierzlech huet bioaktive Fluorescein (Fl)-markéiert GA19,20 d'Akkumulation vu GA am Root-Endokortex an d'Reguléierung vu senge celluläre Niveauen duerch GA Transport opgedeckt. Viru kuerzem huet de GA FRET Sensor nlsGPS1 gewisen datt GA Niveauen korreléieren mat Zellverlängerung a Wuerzelen, Filamenter an donkel gewuess Hypokotylen21. Wéi och ëmmer, wéi mir gesinn hunn, ass d'GA Konzentratioun net deen eenzege Parameter deen d'GA Signalaktivitéit kontrolléiert, well et hänkt vu komplexe Senséierungsprozesser of. Hei, op eisem Verständnis vun den DELLA a GA Signalweeër bauen, berichte mir d'Entwécklung an d'Charakteriséierung vun engem Degradatiounsbaséierte ratiometresche Biosensor fir GA Signaliséierung. Fir dëse quantitative Biosensor z'entwéckelen, hu mir e mutant GA-sensibel RGA benotzt, deen zu engem fluoreszent Protein verschmolzelt gouf an iwwerall an Stoffer ausgedréckt gouf, souwéi e GA-onsensibel fluoreszent Protein. Mir weisen datt d'mutant RGA Proteinfusioune net mat endogene GA-Signaliséierung stéieren wann se ubiquitär ausgedréckt sinn, an datt dëse Biosensor d'Signalaktivitéit quantifizéiere kann, déi vu béide GA-Input an GA-Signalveraarbechtung vum Sensungsapparat mat héijer spatiotemporaler Opléisung resultéiert. Mir hunn dëse Biosensor benotzt fir d'spatiotemporal Verdeelung vun der GA Signalaktivitéit ze kartéieren an ze quantifizéieren wéi GA cellulär Verhalen an der SAM Epidermis reguléiert. Mir weisen datt GA d'Orientéierung vun der Divisiounsfläch vun SAM Zellen tëscht Uergel Primordia reguléiert, an doduerch déi kanonesch cellulär Organisatioun vun der Internode definéiert.
Schlussendlech hu mir gefrot ob qmRGA Ännerungen an endogenen GA Niveauen mat wuesse Hypokotyle mellen. Mir hu virdru gewisen datt Nitrat de Wuesstum stimuléiert andeems d'GA-Synthese erhéicht gëtt an ofwiesselnd d'DELLA34-Degradatioun. Deementspriechend, observéiert mir datt hypocotyl Längt an pUBQ10 :: qmRGA seedlings ënner reichend Nitratversuergung ugebaut (10 mm NO3-) däitlech méi laang war wéi déi an seedlings ënner Nitrat-mangel Konditiounen ugebaut (Ergänzlech Lalumi 6a). Konsequent mat der Wuesstem Äntwert, GA Signaler waren méi héich an hypocotyls vun seedlings ënner 10 mm NO3- Konditiounen ugebaut wéi an seedlings an der Verontreiung vun Nitratveruerdnung (Ergänzlech Lalumi 6b, c). Also erméiglecht qmRGA och d'Iwwerwaachung vun Ännerungen an der GA Signaliséierung induzéiert duerch endogene Verännerungen an der GA Konzentratioun.
Fir ze verstoen ob d'GA-Signaliséierungsaktivitéit, déi duerch qmRGA festgestallt gëtt, hänkt vun der GA Konzentratioun an der GA Perceptioun of, wéi erwaart baséiert op dem Sensordesign, analyséiert mir den Ausdrock vun den dräi GID1 Rezeptoren an vegetativen a reproduktive Stoffer. An seedlings, der GID1-GUS reporter Linn gewisen, datt GID1a an c héich an cotyledons ausgedréckt goufen (Lalumi 3a-c). Zousätzlech goufen all dräi Rezeptoren a Blieder ausgedréckt, lateral Root Primordia, Root Tipps (ausser fir d'Wurzelkapp vun GID1b) an de vaskuläre System (Fig. 3a-c). An der Bléiestänn SAM, hu mir GUS Signaler nëmme fir GID1b an 1c (Ergänzlech Fig. 7a-c) festgestallt. In situ hybridization bestätegt dës Ausdrock Musteren a weider bewisen, datt GID1c op nidderegen Niveauen an der SAM eenheetlech ausgedréckt war, iwwerdeems GID1b héich Ausdrock op der Peripherie vun der SAM gewisen (Ergänzlech Lalumi 7d-l). D'pGID1b :: 2xmTQ2-GID1b translational Fusioun réischt och eng graded Gamme vu GID1b Ausdrock, aus niddereg oder keen Ausdrock am Zentrum vun der SAM zu héich Ausdrock op der Uergel Grenzen (Ergänzlech Lalumi 7m). Also sinn GID1 Rezeptoren net eenheetlech iwwer a bannent Stoffer verdeelt. An pafolgende Experimenter, observéiert mir och dass overexpression vun GID1 (pUBQ10 :: GID1a-mCherry) d'Sensibilitéit vun qmRGA zu hypocotyls zu externen GA Applikatioun fräi (Lalumi 3d, e). Am Géigesaz, war fluorescence gemooss vun qd17mRGA an der hypocotyl unsensitive zu GA3 Behandlung (Lalumi 3f, g). Fir béid Assays goufen Séiwierker mat héije Konzentratioune vu GA (100 μM GA3) behandelt fir de schnelle Verhalen vum Sensor ze bewäerten, wou d'Fäegkeet fir dem GID1 Rezeptor ze bindelen verstäerkt oder verluer war. Zesumme bestätegen dës Resultater datt de qmRGA Biosensor eng kombinéiert Funktioun als GA- a GA-Sensor déngt, a proposéiere datt den differentiellen Ausdrock vum GID1-Rezeptor d'Emissivitéit vum Sensor wesentlech moduléiere kann.
Bis haut bleift d'Verdeelung vu GA Signaler am SAM onkloer. Dofir, benotzt mir qmRGA-ausdrock Planzen an der pCLV3 :: mCherry-NLS Stammzellenfuerschung reporter35 héich-Resolutioun quantitativ Kaarte vun GA Signal Aktivitéit ze berechnen, Schwéierpunkt op der L1 Layer (epidermis; Lalumi 4a, b, gesinn Methoden an Zousaz Methoden), zanter L1 spillt eng Schlësselroll SAM Wuesstem an Kontroll Roll36. Hei huet pCLV3 :: mCherry-NLS Ausdrock e fixe geometresche Referenzpunkt zur Analyse vun der spatiotemporaler Verdeelung vun der GA-Signalaktivitéit37. Obwuel GA als essentiel fir saitlech Uergel Entwécklung4 considéréiert ass, observéiert mir dass GA Signaler niddereg am floral primordium waren (P) ugefaange vun der P3 Etapp (Lalumi 4a, b), iwwerdeems jonk P1 an P2 primordiums moderéiert Aktivitéit ähnlech zu deem an der Mëtt Regioun haten (Lalumi 4a, b). Méi héich GA-Signaliséierungsaktivitéit gouf um Uergel Primordium Grenzen festgestallt, ugefaange bei P1 /P2 (op de Säiten vun der Grenz) a Peak bei P4, wéi och an all Zellen vun der Randerscheinung tëscht der Primordia (Lalumi 4a, b an Zousaz Lalumi 8a, b). Dës méi héich GA-Signaliséierungsaktivitéit gouf net nëmmen an der Epidermis observéiert, awer och an der L2 an der ieweschter L3 Schichten (Ergänzlech Fig. 8b). D'Muster vun GA Signaler am SAM entdeckt benotzt qmRGA blouf och onverännert mat der Zäit (Ergänzlech Fig. 8c-f, k). Obwuel d'qd17mRGA Konstruktioun systematesch am SAM vun T3 Planzen aus fënnef onofhängeg Linnen downregulated war, datt mir am Detail charakteriséiert, mir konnten d'fluorescence Mustere mat der pRPS5a kritt :: VENUS-2A-TagBFP Konstruktioun ze analyséieren (Ergänzlech Lalumi 8g-j, l). An dëser Kontrolllinn goufen nëmmen kleng Ännerungen am Fluoreszenzverhältnis am SAM festgestallt, awer am SAM-Zentrum hu mir eng kloer an onerwaart Ofsenkung vun der VENUS mat TagBFP observéiert. Dëst bestätegt datt d'Signalisatiounsmuster observéiert vu qmRGA GA-ofhängeg Degradatioun vu mRGA-VENUS reflektéiert, awer beweist och datt qmRGA GA-Signalaktivitéit am Meristemzentrum iwwerschätzt kann. Zesummegefaasst, weisen eis Resultater e GA-Signaliséierungsmuster dat haaptsächlech d'Verdeelung vu Primordia reflektéiert. Dës Verdeelung vun der interprimordialer Regioun (IPR) ass wéinst der gradueller Etablissement vun enger héijer GA-Signalaktivitéit tëscht dem entwéckelende Primordium an der Zentralregioun, während gläichzäiteg d'GA-Signalaktivitéit am Primordium erofgeet (Fig. 4c, d).
D'Verdeelung vu GID1b a GID1c Rezeptoren (kuckt hei uewen) suggeréiert datt differenziell Ausdrock vun GA Rezeptoren hëlleft d'Muster vun der GA Signalaktivitéit am SAM ze formen. Mir hu gefrot ob d'Differentialakkumulatioun vu GA involvéiert wier. Fir dës Méiglechkeet z'ënnersichen, hu mir den nlsGPS1 GA FRET Sensor21 benotzt. Erhéicht Aktivéierungsfrequenz gouf an der SAM vun nlsGPS1 festgestallt, behandelt mat 10 μM GA4 + 7 fir 100 min (Ergänzung Fig. 9a-e), wat beweist datt nlsGPS1 op Ännerungen an der GA Konzentratioun am SAM reagéiert, wéi et an roots21 mécht. Raimlech Verdeelung vun nlsGPS1 Aktivéierungsfrequenz réischt relativ niddereg GA Niveauen an de baussenzege Schichten vun der SAM, mä huet gewisen, datt se am Zentrum an op de Grenze vun der SAM (Fig. 4e an Zousaz Lalumi 9a, c). Dëst hindeit datt GA och am SAM verdeelt ass mat engem raimleche Muster vergläichbar mat deem wat qmRGA opgedeckt huet. Als komplementar Approche, behandelt mir och de SAM mat fluorescent GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) oder Fl eleng als negativ Kontroll. D'Fl Signal war uechter d'SAM verdeelt, dorënner d'Zentralregioun an Primordium, obwuel bei enger méi niddereg Intensitéit (Figebam. 4j an Zousaz Lalumi 10d). Am Géigesaz, all dräi GA-Fl cumuléiert speziell bannent de Primordium Grenzen a variéieren Grad am Rescht vun der IPR, mat GA7-Fl cumuléiert am gréissten Domain an der IPR (Fig. 4k an Zousaz Fig. 10a, b). Quantifikatioun vun fluorescence Intensitéit verroden, datt d'IPR zu Net-IPR Intensitéit Verhältnis méi am GA-Fl-behandelt SAM Verglach zu Fl-behandelt SAM (Lalumi 4l an Zousaz Lalumi 10c) war. Zesummen suggeréieren dës Resultater datt GA bei méi héije Konzentratioune an IPR Zellen präsent ass, déi am nootsten un der Uergelgrenz sinn. Dëst hindeit datt d'Muster vun der SAM GA Signalaktivitéit Resultater vu béiden differentiellen Ausdrock vun GA Rezeptoren an differenziell Akkumulation vun GA an IPR Zellen no Uergelgrenzen. Also huet eis Analyse en onerwaart spatiotemporalt Muster vun der GA-Signaliséierung opgedeckt, mat enger niddereger Aktivitéit am Zentrum an dem Primordium vun der SAM a méi héijer Aktivitéit am IPR an der Peripherieregioun.
Fir d'Roll vun differentiell GA sécher Aktivitéit am SAM ze verstoen, analyséiert mir d'Korrelatioun tëscht GA sécher Aktivitéit, Zell Expansioun, an Zell Divisioun real-Zäit Zäit-Laps Imaging vun der SAM qmRGA pCLV3 :: mCherry-NLS benotzt. Kritt der Roll vun GA am Wuesstem Regulatioun, eng positiv Korrelatioun mat Zell Expansioun Parameteren war erwaart. Dofir, verglach mir éischt GA Signal Aktivitéit Kaarte mat Kaarten vun Zell Uewerfläch Wuesstem Taux (als Proxy fir d'Stäerkt vun Zell Expansioun fir eng bestëmmte Zell a fir Duechter Zellen op Divisioun) a mat Kaarten vun Wuesstem anisotropy, déi Mesuren der Directionality vun Zell Expansioun (och hei benotzt fir eng bestëmmten Zell a fir Duechter Zellen op Divisioun; Fig. 5a, b, gesinn Methoden an Zousaz Methoden). Eis Kaarte vun SAM Zell Uewerfläch Wuesstem Taux sinn konsequent mat virdrun Observatioune38,39, mat minimal Wuesstem Tariffer op der Grenz a maximal Wuesstem Tariffer an Entwécklungslänner Blummen (Lalumi 5a). Haaptkomponent Analyse (PCA) huet gewisen datt d'GA-Signaliséierungsaktivitéit negativ mat der Zelloberflächewuesstemintensitéit korreléiert war (Dorënner 5c). Mir hunn och gewisen, datt d'Haaptachs vun Variatioun, dorënner GA Signal Input a Wuesstem Intensitéit, orthogonal zu der Richtung duerch héich CLV3 Ausdrock bestëmmt goufen, confirméiert der Ausgrenzung vun Zellen aus der SAM Zentrum an de Rescht Analysë. Spearman Korrelatiounsanalyse bestätegt d'PCA Resultater (Figure 5d), wat beweist datt méi héich GA Signaler an der IPR net zu méi héijer Zellexpansioun gefouert hunn. Wéi och ëmmer, Korrelatiounsanalyse huet eng liicht positiv Korrelatioun tëscht GA-Signaliséierungsaktivitéit a Wuesstumanisotropie opgedeckt (Dorënner 5c, d), suggeréiert datt méi héich GA-Signalisatioun an der IPR d'Richtung vum Zellwachstum beaflosst an eventuell d'Positioun vun der Zell Divisiounsfläch.
a, b Hëtzt Kaarte vun heescht Uewerfläch Wuesstem (a) a Wuesstem anisotropy (b) an SAM Moyenne iwwer siwen onofhängeg Planzen (als Proxy fir d'Kraaft a Richtung vun Zell Expansioun benotzt, respektiv). c PCA Analyse abegraff déi folgend Verännerlechen: GA Signal, Uewerfläch Wuesstem Intensitéit, Uewerfläch Wuesstem anisotropy, an CLV3 Ausdrock. PCA Komponent 1 war haaptsächlech negativ mat Uewerfläch Wuesstem Intensitéit korreléiert a positiv mat GA Signal korreléiert. PCA Komponent 2 war haaptsächlech positiv mat Uewerfläch Wuesstem anisotropy korreléiert an negativ mat CLV3 Ausdrock korreléiert. Prozentsaz representéieren d'Variatioun vun all Komponent erkläert. d Spearman Korrelatioun Analyse tëscht GA Signal, Uewerfläch Wuesstem Intensitéit, an Uewerfläch Wuesstem anisotropy op der Tissue Skala ausser CZ. D'Zuel op der rietser ass de Spearman rho Wäert tëscht zwou Variabelen. Asterisken weisen Fäll wou d'Korrelatioun / negativ Korrelatioun héich bedeitend ass. e 3D Visualiséierung vu Col-0 SAM L1 Zellen duerch konfokal Mikroskopie. Nei Zellmaueren, déi am SAM geformt ginn (awer net am Primordium) um 10 h sinn faarweg no hire Wénkelwäerter. D'Faarfbar gëtt an der ënneschter rechter Ecke gewisen. Den Inset weist dat entspriechend 3D Bild op 0 h. D'Experiment gouf zweemol widderholl mat ähnlechen Resultater. f Box Diagrammer weisen Zell Divisioun Tariffer an IPR an Net-IPR Col-0 SAM (n = 10 onofhängeg Planzen). D'Mëttlinn weist de Median, an d'Këschtgrenzen weisen de 25. an 75. Prozent. Whiskers weisen op d'Mindest- a Maximalwäerter, déi mat R Software bestëmmt ginn. P Wäerter goufen mam Welch's zwee-tailed T-Test kritt. g, h Schematesch Diagramm weist (g) wéi de Wénkel vun der neier Zellmauer (Magenta) mat Respekt zu der radialer Richtung aus dem Zentrum vun der SAM (wäiss Punktelinn) gemooss gëtt (nëmmen spëtze Wénkelwäerter, dh 0-90°, gi berücksichtegt), an (h) déi circumferential / lateral a radial Richtungen am Meristem. ech Frequenz histograms vun Zell Divisioun Fliger Orientatioun iwwer de SAM (donkel blo), IPR (mëttel blo), an Net-IPR (Liicht blo), respektiv. P Wäerter goufen duerch eng zwee-tailed Kolmogorov-Smirnov Test kritt. D'Experiment gouf zweemol widderholl mat ähnlechen Resultater. j Frequenz histograms vun Zell Divisioun Fliger Orientatioun vun der IPR ronderëm P3 (hell gréng), P4 (mëttelgrouss gréng), an P5 (donkel gréng), respektiv. P Wäerter goufen duerch eng zwee-tailed Kolmogorov-Smirnov Test kritt. D'Experiment gouf zweemol widderholl mat ähnlechen Resultater.
Dofir, propagéieren mir nächst d'Korrelatioun tëscht GA sécher an Zell Divisioun Aktivitéit vun nei geformt Zell Maueren während der assay z'identifizéieren (Lalumi 5e). Dës Approche huet eis erlaabt d'Frequenz an d'Richtung vun der Zell Divisioun ze moossen. Iwwerraschend hu mir festgestallt, datt d'Frequenz vun Zelldivisiounen am IPR an de Rescht vun der SAM (Net-IPR, Fig. 5f) ähnlech war, wat beweist datt Differenzen an der GA-Signaliséierung tëscht IPR an Net-IPR Zellen net däitlech d'Zell Divisioun beaflossen. Dëst, an déi positiv Korrelatioun tëscht GA-Signaliséierung a Wuesstumanisotropie, huet eis opgefuerdert ze berécksiichtegen ob GA-Signaliséierungsaktivitéit d'Orientéierung vun der Zell Divisiounsfläch beaflosse kéint. Mir hunn d'Orientéierung vun der neier Zellmauer als spëtze Wénkel relativ zu der radialachs gemooss, déi de Meristemzentrum an den Zentrum vun der neier Zellmauer verbënnt (Fig. 5e-i) a beobachtet eng kloer Tendenz fir Zellen sech bei Winkelen no bei 90 ° par rapport zu der radialer Achs ze deelen, mat den héchste Frequenzen observéiert bei 8 ° 9 an ° 8. (22,62%) (Figebam. 5e, ech), entspriechend Zell Divisiounen am circumferential / transversal Richtung (Figebam. 5h). Fir de Bäitrag vun GA-Signalisatioun zu dëser Zell Divisioun Verhalen z'ënnersichen, analyséiert mir Zell Divisioun Parameteren an der IPR an Net-IPR getrennt (Figebam. 5i). Mir beobachtet datt d'Divisiounswénkelverdeelung an IPR Zellen ënnerscheet vun deem an Net-IPR Zellen oder an Zellen am ganze SAM, mat IPR Zellen déi e méi héijen Undeel vu saitlech /kreesfërmeg Zell Divisiounen weisen, dh 70-80 ° an 80-90 ° (33,86% an 30,71%, respektiv 5, entspriechend Proportiounen). Sou, verroden eis Observatioune eng Associatioun tëscht héich GA sécher an enger Zell Divisioun Fliger Orientatioun no bei der circumferential Richtung, ähnlech zu der Korrelatioun tëscht GA sécher Aktivitéit a Wuesstem anisotropy (Lalumi 5c, d). Fir weider d'raimlech Konservatioun vun dëser Associatioun etabléieren, gemooss mir d'Divisioun Fliger Orientatioun an IPR Zellen ronderëm de primordium ugefaange vun P3, well déi héchste GA sécher Aktivitéit an dëser Regioun ugefaang aus P4 (Lalumi 4) fonnt gouf. D'Divisiounswénkel vun der IPR ëm P3 a P4 hu keng statistesch bedeitend Differenzen gewisen, obwuel eng erhéicht Frequenz vu saitlech Zell Divisiounen an der IPR ëm P4 observéiert gouf (Fig. 5j). Wéi och ëmmer, an den IPR Zellen ëm P5 gouf den Ënnerscheed an der Orientéierung vun der Zell Divisiounsfläch statistesch bedeitend, mat enger schaarfer Erhéijung vun der Frequenz vun transversale Zell Divisiounen (Fig. 5j). Zesummen suggeréieren dës Resultater datt GA-Signaliséierung d'Orientéierung vun Zelldivisiounen am SAM kontrolléiere kann, wat konsequent mat fréiere Berichter40,41 ass, datt héich GA-Signaliséierung lateral Orientéierung vun Zelldivisiounen am IPR induzéieren kann.
Et gëtt virausgesot datt Zellen am IPR net an Primordia agebaut ginn, mee éischter an Internoden2,42,43. Déi transversal Orientéierung vun Zelldivisiounen am IPR kann zu der typescher Organisatioun vu parallele Längsreihen vun Epidermalzellen an Internoden entstoen. Eis Observatioune uewen beschriwwe suggeréieren datt GA Signaliséierung méiglecherweis eng Roll an dësem Prozess spillt andeems d'Richtung vun der Zell Divisioun reguléiert.
Verloscht vun Funktioun vun e puer DELLA Genen Resultater an engem konstitutiv GA Äntwert, an della mutants kann benotzt ginn dëser Hypothes ze Test44. Mir analyséiert éischt den Ausdrock Mustere vu fënnef DELLA Genen am SAM. Transkriptiouns Fusioun vun der GUS line45 verroden, datt GAI, RGA, RGL1, an RGL2 (zu engem vill manner Mooss) am SAM ausgedréckt goufen (Ergänzlech Lalumi 11a-d). In situ hybridization weider bewisen, datt GAI mRNA cumuléiert speziell an primordia an Entwécklungslänner Blummen (Ergänzlech Fig. 11e). RGL1 an RGL3 mRNA sech am ganze SAM Canopy an an eeler Blummen fonnt, iwwerdeems RGL2 mRNA an der Grenz Regioun méi reichend war (Ergänzlech Lalumi 11f-h). Confocal Imaging vun pRGL3 :: RGL3-GFP SAM bestätegt den Ausdrock vun an situ hybridization observéiert a gewisen, datt RGL3 Protein am zentrale Deel vun der SAM cumuléiert (Ergänzlech Lalumi 11i). Mat der pRGA :: GFP-RGA Linn, hu mir och fonnt, datt RGA Protein am SAM cumuléiert, mä seng Heefegkeet erofgoen op der Grenz ab P4 (Ergänzlech Lalumi 11j). Notamment sinn d'Ausdrock Mustere vun RGL3 an RGA konsequent mat héijer GA sécher Aktivitéit am IPR, wéi vun qmRGA (Lalumi 4) festgestallt. Ausserdeem, weisen dës Donnéeën datt all DELLAs am SAM ausgedréckt sinn an datt hiren Ausdrock kollektiv de ganze SAM spant.
Mir analyséiert nächst der Zell Divisioun Parameteren am wëll-Typ SAM (Ler, Kontroll) an der gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) mutants (Lalumi 6a, b). Spannen, observéiert mir eng statistesch bedeitendst Verréckelung vun der Verdeelung vun Zell Divisioun Wénkel Frequenzen am della global mutant SAM Verglach zu der wëll Typ (Lalumi 6c). Dës Ännerung vun der della global mutant war wéinst enger Erhéijung vun der Frequenz vun 80-90 ° Wénkel (34,71% vs. 24,55%) an, zu engem manner Mooss, 70-80 ° Wénkel (23,78% vs. 20,18%), dh entspriechend transversal Zell Divisiounen (Fig. 6c). D'Frequenz vun Net-transversal Divisiounen (0-60 °) war och manner an der della global mutant (Lalumi 6c). D'Frequenz vun transversal Zell Divisiounen war bedeitend an der SAM vun der della global mutant (Lalumi 6b) fräi. D'Frequenz vun transversal Zell Divisiounen am IPR war och méi héich an der della global mutant Verglach zu der wëll Typ (Lalumi 6d). Ausserhalb vun der IPR Regioun, huet d'Wild Typ eng méi eenheetlech Verdeelung vun Zell Divisioun Wénkel, iwwerdeems d'della global mutant tangential Divisiounen wéi d'IPR (Lalumi 6e) léiwer. Mir quantifizéiert och d'Orientéierung vun Zell Divisiounen am SAM vun ga2 oxidase (ga2ox) quintuple Mutanten (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, an ga2ox6-2), engem GA-inaktiven mutant Hannergrond an deem GA accumuléiert. Konsequent mat der Erhéijung vun GA Niveauen, der SAM vun der quintuple ga2ox mutant inflorescence war méi grouss wéi déi vun Col-0 (Ergänzlech Fig. 12a, b), an am Verglach zu Col-0, der quintuple ga2ox SAM huet eng däitlech aner Verdeelung vun Zell Divisioun Wénkel, mat der 9000 Tangential Frequenz zu Erhéijung vun der Wénkel 500 ° Erhéijung. Divisiounen (Ergänzungsbild 12a-c). Also weisen mir datt konstitutiv Aktivatioun vu GA Signaliséierung a GA Akkumulation lateral Zell Divisiounen an der IPR an de Rescht vun der SAM induzéieren.
eng, b 3D Visualiséierung vun der L1 Layer vun PI-gefierft Ler (eng) a global della mutant (b) SAM benotzt confocal microscopy. Nei Zellmaueren, déi am SAM geformt sinn (awer net am Primordium) iwwer eng 10-h Period ginn ugewisen a faarweg no hire Wénkelwäerter. Den Inset weist de SAM bei 0 h. D'Faarfbar gëtt an der ënneschter rechter Ecke ugewisen. De Pfeil an (b) weist op e Beispill vun ausgeriicht Zelldateien an der globaler Della Mutant. D'Experiment gouf zweemol widderholl mat ähnlechen Resultater. ce Verglach vun der Frequenz Verdeelung vun Zell Divisioun Fliger Orientatiounen am ganze SAM (d), IPR (e), an Net-IPR (f) tëscht Ler a global della. P Wäerter goufen mat engem zwee-tailed Kolmogorov-Smirnov Test kritt. f, g 3D Visualiséierung vun confocal Biller vun PI-gefierft SAM vun Col-0 (ech) an pCUC2 :: gai-1-VENUS (j) transgenic Planzen. Panelen (a, b) weisen nei Zellmaueren (awer net Primordia) déi am SAM bannent 10 h geformt sinn. D'Experiment gouf zweemol widderholl mat ähnlechen Resultater. h-j Verglach vun der Frequenz Verdeelung vun Zell Divisioun Fliger Orientatioune läit am ganze SAM (h), IPR (ech) an Net-IPR (j) tëscht Col-0 an pCUC2 :: gai-1-VENUS Planzen. P Wäerter goufen mat engem zwee-tailed Kolmogorov-Smirnov Test kritt.
Mir hunn als nächst den Effekt vun der Inhibitioun vun der GA-Signaliséierung speziell am IPR getest. Fir dëst Enn, benotzt mir d'cotyledon Coupe 2 (CUC2) Promoteur Ausdrock vun engem dominant negativ gai-1 FAQ ze VENUS fusionéiert (an der pCUC2 :: gai-1-VENUS Linn) ze fueren. Am Wild-Typ SAM, fiert de CUC2 Promoteur Ausdrock vun stäerkste IPRs am SAM, dorënner Grenz Zellen, aus P4 un, an ähnlechen spezifeschen Ausdrock war an pCUC2 observéiert :: gai-1-VENUS Planzen (kuckt hei ënnendrënner). D'Verdeelung vun Zell Divisioun Wénkel ganze SAM oder IPR vun pCUC2 :: gai-1-VENUS Planzen war net vill anescht wéi déi vun der wëll Typ, obwuel onerwaart mir fonnt dass Zellen ouni IPR an dëse Planzen op eng méi héich Frequenz vun 80-90 ° (Lalumi 6f-j) ënnerdeelt.
Et gouf virgeschloen datt d'Richtung vun der Zell Divisioun vun der Geometrie vum SAM hänkt, besonnesch de Spannspannung, deen duerch d'Tissuekrümmung generéiert gëtt46. Mir gefrot also ob d'Form vun der SAM am della global mutant an pCUC2 :: gai-1-VENUS Planzen geännert gouf. Wéi virdrun12 gemellt, war d'Gréisst vun der della global mutant SAM méi grouss wéi déi vun der wëll Typ (Ergänzlech Lalumi 13a, b, d). In situ hybridization vun CLV3 an STM RNS confirméiert der meristem Expansioun an della mutants a weist weider der saitlech Expansioun vun der Stammzellenfuerschung Nisch (Ergänzlech Lalumi 13e, f, h, ech). Allerdéngs war d'SAM curvature ähnlech zu souwuel genotypes (Ergänzlech Lalumi 13k, m, n, p). Mir hunn eng ähnlech Erhéijung vun der Gréisst an der gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della véiermol mutant observéiert ouni eng Verännerung vun der Krümmung am Verglach zu der Wildart (Ergänzlech Lalumi 13c, d, g, j, l, o, p). D'Frequenz vun Zell Divisioun Orientatioun war och am della véiermol mutant betraff, mä zu engem manner Mooss wéi an der della monolithic mutant (Ergänzlech Lalumi 12d-f). Dës Doséierungseffekt, zesumme mam Mangel vun engem Effekt op Krümmung, hindeit datt d'RGL3 Aktivitéit an der Della véiermol mutant Ännerungen an der Zell Divisioun Orientéierung limitéiert duerch Verloscht vun DELLA Aktivitéit verursaacht an datt Ännerungen am saitlech Zell Divisiounen geschéien an Äntwert op Ännerungen an GA Signal Aktivitéit amplaz Ännerungen an SAM Geometrie. Wéi uewen beschriwwen, fiert de CUC2 Promoteur IPR Ausdrock am SAM ugefaange um P4 (Ergänzlech Lalumi 14a, b), an am Géigesaz, der pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM hat eng reduzéiert Gréisst awer méi héich curvature (Ergänzlech Lalumi 14c-h). Dës Ännerung am pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM Morphologie kann zu enger anerer Verdeelung vu mechanesche Spannungen am Verglach zum Wëllentyp resultéieren, an deem héich Ëmgéigend Spannungen op enger méi kuerzer Distanz vum SAM Zentrum ufänken47. Alternativ kënnen d'Verännerungen an pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM Morphologie aus Ännerungen an regionalen mechanesche Properties resultéieren, déi duerch transgen Ausdrock48 induzéiert ginn. A béide Fäll kéint dëst d'Effekter vun Verännerungen an der GA-Signaliséierung deelweis kompenséieren andeems d'Wahrscheinlechkeet erhéicht gëtt datt d'Zellen sech an der circumferential / transversaler Orientéierung deelen, wat eis Observatioune erkläert.
Zesummegefaasst bestätegen eis Donnéeën datt méi héich GA-Signaliséierung eng aktiv Roll an der lateraler Orientéierung vum Zell Divisiounsplang am IPR spillt. Si weisen och datt d'Meristem Krümmung och d'Orientéierung vum Zell Divisiounsplang am IPR beaflosst.
Déi transversal Orientéierung vun der Divisiounsfläch am IPR, wéinst der héijer GA-Signalaktivitéit, proposéiert datt GA eng radial Zelldatei an der Epidermis bannent der SAM pre-organiséiert fir d'zellulär Organisatioun ze definéieren, déi spéider an der epidermaler Internode fonnt gëtt. Tatsächlech waren esou Zell Fichieren dacks siichtbar an SAM Biller vun della global mutants (Lalumi 6b). Also, fir weider d'Entwécklungsfunktioun vum raimleche Muster vun der GA-Signaliséierung an der SAM z'entdecken, hu mir Time-Lapse Imaging benotzt fir d'raimlech Organisatioun vun Zellen an der IPR an Wild-Typ (Ler a Col-0), della global Mutanten an pCUC2 :: gai-1-VENUS transgene Planzen ze analyséieren.
Mir hunn erausfonnt datt qmRGA gewisen huet datt d'GA-Signaliséierungsaktivitéit am IPR vu P1 /P2 eropgaang ass an um P4 eropgeet, an dëst Muster blouf konstant iwwer Zäit (Figebam. 4a-f an Zousaz Lalumi 8c-f, k). Fir d'raimlech Organisatioun vun Zellen am IPR mat Erhéijung GA Signal ze analyséieren, mir Ler IPR Zellen uewen an op de Säiten vun P4 Label no hirem Entwécklungslänner Schicksal analyséiert 34 h no der éischter Observatioun, dh méi wéi zwee plastid mol, erlaabt eis IPR Zellen während Primordium Entwécklung vun P1 /P2 zu P4 ze verfollegen. Mir hunn dräi verschidde Faarwen benotzt: giel fir déi Zellen, déi an de Primordium bei P4 integréiert waren, gréng fir déi, déi an der IPR waren, a purpur fir déi, déi u béide Prozesser deelgeholl hunn (Fig. 7a-c). Um t0 (0 h), 1-2 Schichten vun IPR Zellen sech virun P4 siichtbar (Lalumi 7a). Wéi erwaart, wann dës Zellen sech opgedeelt, hu se dat haaptsächlech iwwer de transversale Divisiounsplang gemaach (Fig. 7a-c). Ähnlech Resultater goufen mat Col-0 SAM kritt (op P3 fokusséiert, deem seng Grenz ähnlech wéi P4 zu Ler klappt), obwuel an dësem Genotyp de Falt, deen op der Blummengrenz geformt ass, d'IPR Zellen méi séier verstoppt huet (Fig. 7g-i). Also, d'Divisiounsmuster vun IPR Zellen pre-organiséiert d'Zellen a radial Reihen, wéi an Internoden. D'Organisatioun vu radial Reihen an d'Lokaliséierung vun IPR Zellen tëscht successive Organer suggeréieren datt dës Zellen internodal Progenitoren sinn.
Hei hu mir e ratiometrische GA-Signaliséierungsbiosensor entwéckelt, qmRGA, deen quantitativ Kartéierung vun GA-Signalaktivitéiten erlaabt, déi aus kombinéierte GA- a GA-Rezeptor Konzentratioune resultéiert, wärend d'Interferenz mat endogenen Signalweeër miniméiert, an doduerch Informatioun iwwer GA-Funktioun um cellulären Niveau liwwert. Zu dësem Zweck hu mir e modifizéierten DELLA Protein, mRGA, konstruéiert, deen d'Fäegkeet verluer huet DELLA Interaktiounspartner ze binden, awer sensibel fir GA-induzéiert Proteolyse bleift. qmRGA reagéiert souwuel op exogen an endogen Verännerungen am GA Niveauen, a seng dynamesch Sensungseigenschaften erméiglechen d'Bewäertung vu spatiotemporalen Verännerungen an der GA Signalaktivitéit wärend der Entwécklung. qmRGA ass och e ganz flexibel Tool well et kann u verschiddenen Stoffer ugepasst ginn andeems de Promoteur fir säin Ausdrock geännert gëtt (wann néideg), a mat der konservéierter Natur vum GA Signalwee an dem PFYRE Motiv iwwer Angiospermen, ass et méiglecherweis op aner Spezies transferéierbar22. Konsequent mat dësem, eng gläichwäerteg Mutatioun am Reis SLR1 DELLA Protein (HYY497AAA) gouf och gewisen fir d'Wuesstumsrepressoraktivitéit vu SLR1 z'ënnerdrécken, während nëmmen e bësse seng GA-mediéiert Degradatioun reduzéiert, ähnlech wéi mRGA23. Notamment hunn rezent Studien an Arabidopsis gewisen datt eng eenzeg Aminosaier Mutatioun am PFYRE Domain (S474L) d'Transkriptiounsaktivitéit vum RGA geännert huet ouni seng Fäegkeet ze beaflossen mat Transkriptiounsfaktor Partner50 ze interagéieren. Och wann dës Mutatioun ganz no bei den 3 Aminosäuresubstitutiounen ass, déi am mRGA präsent sinn, weisen eis Studien datt dës zwou Mutatiounen ënnerschiddlech Charakteristike vun DELLA änneren. Och wann déi meescht Transkriptiounsfaktor Partner un d'LHR1 a SAW Domainen vun DELLA26,51 binden, kënnen e puer konservéiert Aminosäuren am PFYRE Domain hëllefen dës Interaktiounen ze stabiliséieren.
Internode Entwécklung ass e Schlësselcharakteristik an der Planzarchitektur an der Ausbezueleverbesserung. qmRGA huet méi héich GA Signalaktivitéit an IPR Internode Progenitor Zellen opgedeckt. Duerch d'Kombinatioun vu quantitativen Imaging a Genetik hu mir gewisen datt GA Signaliséierungsmuster kreesfërmeg / transversal Zell Divisiounsflächen an der SAM Epidermis iwwerlageren, d'Zell Divisiounsorganisatioun geformt fir d'Internode Entwécklung néideg. Verschidde Reguléierer vun der Zell Divisioun Fliger Orientéierung goufen während Entwécklung identifizéiert52,53. Eis Aarbecht bitt e kloert Beispill vu wéi GA Signalaktivitéit dësen celluläre Parameter reguléiert. DELLA kann mat prefolding Protein Complexes41 interagéieren, sou datt GA Signaliséierung d'Zell Divisioun Fliger Orientéierung reguléiere kann andeems se d'kortikale Mikrotubule Orientéierung40,41,54,55 direkt beaflossen. Mir hunn onerwaart gewisen datt am SAM de Korrelat vu méi héijer GA-Signalaktivitéit net Zellverlängerung oder Divisioun war, awer nëmmen Wuesstumanisotropie, wat konsequent mat engem direkten Effekt vum GA op d'Richtung vun der Zell Divisioun am IPR ass. Mir kënnen awer net ausschléissen datt dësen Effekt och indirekt kéint sinn, zum Beispill duerch GA-induzéiert Zellmauerweichung56 vermëttelt. Ännerungen an Zellmauer Eegeschafte induzéieren mechanesch Stress57,58, wat och d'Orientéierung vun der Zell Divisioun Fliger beaflosse kann duerch d'Orientatioun vun cortical microtubules Afloss39,46,59. D'kombinéiert Effekter vum GA-induzéierte mechanesche Stress an der direkter Reguléierung vun der Mikrotubule Orientéierung duerch GA kënne involvéiert sinn fir e spezifescht Muster vun der Zell Divisioun Orientéierung an der IPR ze generéieren fir Internoden ze definéieren, a weider Studie sinn néideg fir dës Iddi ze testen. Ähnlech hu fréier Studien d'Wichtegkeet vun den DELLA-interagéierende Proteinen TCP14 a 15 an der Kontroll vun der Internodebildung beliicht60,61 an dës Faktoren kënnen d'Aktioun vu GA vermëttelen zesumme mat BREVIPEDICELLUS (BP) a PENNYWISE (PNY), déi d'Internode Entwécklung regelen a gewisen hunn, 62 GA Signalisatioun2 ze beaflossen. Virausgesat datt DELLAs interagéieren mat Brassinosteroid, Ethylen, Jasmoninsäure, an Abscisinsäure (ABA) Signalweeër63,64 an datt dës Hormone d'Mikrotubule Orientéierung65 beaflosse kënnen, kënnen d'Effekter vum GA op d'Zell Divisioun Orientéierung och duerch aner Hormone vermëttelt ginn.
Fréi zytologesch Studien weisen datt souwuel déi bannenzeg wéi och baussenzeg Regioune vun der Arabidopsis SAM fir Internode Entwécklung néideg sinn2,42. D'Tatsaach datt GA aktiv Zell Divisioun am banneschten Tissu reguléiert12 ënnerstëtzt eng duebel Funktioun vum GA bei der Reguléierung vun Meristem an Internode Gréisst am SAM. D'Muster vun der Richtungszell Divisioun ass och enk geregelt am banneschten SAM Tissu, an dës Reguléierung ass wesentlech fir Stammwachstum52. Et wäert interessant sinn ze iwwerpréiwen ob GA och eng Roll spillt an der Orientéierung vun der Zell Divisiounsfläch an der bannenzeger SAM Organisatioun, doduerch d'Spezifikatioun an d'Entwécklung vun Internoden am SAM synchroniséiert.
Planzen goufen in vitro am Buedem oder 1x Murashige-Skoog (MS) Medium (Duchefa) ergänzt mat 1% Saccharose an 1% Agar (Sigma) ënner Standardbedéngungen (16 h Liicht, 22 ° C), ausser fir Hypocotyl- a Rootwachstumsexperimenter, an deenen seedlings op vertikale Placke ënner konstantem Liicht an 22 ° C ugebaut goufen. Fir Nitratexperimenter goufen Planzen op modifizéierten MS Medium (BioWORLD Planzmedium) ergänzt mat adäquate Nitrat (0 oder 10 mm KNO3), 0,5 mm NH4-Succinat, 1% Saccharose an 1% A-Agar (Sigma) ënner laangen Dagbedéngungen.
GID1a cDNA an pDONR221 agebaut gouf mat pDONR P4-P1R-pUBQ10 an pDONR P2R-P3-mCherry an pB7m34GW recombinéiert fir pUBQ10 :: GID1a-mCherry ze generéieren. IDD2 DNA an pDONR221 agebaut gouf an pB7RWG266 rekombinéiert fir p35S:IDD2-RFP ze generéieren. Fir pGID1b :: 2xmTQ2-GID1b ze generéieren, goufen e 3,9 kb Fragment upstream vun der GID1b Kodéierungsregioun an e 4,7 kb Fragment mat dem GID1b cDNA (1,3 kb) an Terminator (3,4 kb) fir d'éischt amplifizéiert mat de Primer am Supplementary Table 43 an duerno an PNRs-Table 43 amplifizéiert. Fisher Scientific) an pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), respektiv, a schliisslech rekombinéiert mat pDONR221 2xmTQ268 an de pGreen 012567 Zilvektor mat Gateway Klonen. Fir pCUC2 :: LSSmOrange ze generéieren, gouf d'CUC2 Promoteur Sequenz (3229 bp Upstream vun ATG) gefollegt vun der Kodéierungssequenz vu grousse Stokes-verschiebte mOrange (LSSmOrange) 69 mam N7 Nuklear Lokaliséierungssignal an dem NOS transkriptionalen Terminator goufen an de pGreenway-Ziel-Vektor-Kanamybin-Recommandatiouns-Vektor System zesummegesat. (Invitrogen). De Planz binäre Vektor gouf an Agrobacterium tumefaciens Stamm GV3101 agefouert an an Nicotiana benthamiana Blieder agefouert duerch Agrobacterium Infiltratiounsmethod an an Arabidopsis thaliana Col-0 duerch Blummen Dip Method, respektiv. pUBQ10 :: qmRGA pUBQ10 :: GID1a-mCherry an pCLV3 :: mCherry-NLS qmRGA sech aus der F3 an F1 progenies vun der jeeweileg Kräizer isoléiert, respektiv.
RNA in situ Hybridiséierung gouf op ongeféier 1 cm laange Schéisstips72 gemaach, déi gesammelt an direkt an der FAA Léisung (3,7% Formaldehyd, 5% Essigsäure, 50% Ethanol) virgekillt op 4 °C fixéiert goufen. No 2 × 15 min Vakuumbehandlungen gouf de Fixativ geännert a Proben goufen iwwer Nuecht inkubéiert. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, an RGL3 cDNAs an antisense Sonden op hir 3'-UTRs goufen synthetiséiert benotzt d'primers gewisen an Zousaz Table 3 wéi vun Rosier et al.73 beschriwwen. Digoxigenin-label Sonde goufen immunodetected benotzt digoxigenin antibodies (3000-fach Verdünnung; Roche, Katalognummer: 11 093 274 910), a Rubriken sech mat 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, 250-fach diluetion) /trobluet BT (N) gefierft. 200-fache Verdünnung) Léisung.
Post Zäit: Februar-10-2025