D'Wuesstem vum Spross-Apikalmeristem (SAM) ass entscheedend fir d'Stamm-Architektur. PlanzenhormonenGibberellinen(GAs) spille Schlësselrollen bei der Koordinatioun vum Planzewuesstum, awer hir Roll am SAM bleift schlecht verstanen. Hei hu mir e ratiometresche Biosensor vun der GA-Signalgebung entwéckelt, andeems mir de DELLA-Protein sou manipuléiert hunn, datt en seng essentiell Reguléierungsfunktioun an der GA-Transkriptiounsäntwert ënnerdréckt, während seng Degradatioun bei der GA-Erkennung erhale bleift. Mir weisen datt dësen Degradatiounsbaséierte Biosensor d'Ännerungen an den GA-Niveauen an der zellularer Detektioun während der Entwécklung korrekt ophëlt. Mir hunn dëse Biosensor benotzt fir d'GA-Signalaktivitéit am SAM ze kartéieren. Mir weisen datt héich GA-Signaler haaptsächlech a Zellen präsent sinn, déi sech tëscht Organprimordien befannen, déi Virleefer vun Internodenzellen sinn. Mat Hëllef vu Gain- a Loss-of-function-Methoden weisen mir weider datt GA d'Orientéierung vun der Zelldeelungsfläch reguléiert, déi kanonesch zellulär Organisatioun vun Internoden etabléiert an doduerch d'Internodenspezifizéierung am SAM fördert.
De Sprossapikalmeristem (SAM), deen um Sprossspëtz läit, enthält eng Nisch vu Stammzellen, deenen hir Aktivitéit lateral Organer a Stammknäppchen op eng modular an iterativ Manéier während dem ganze Liewe vun der Planz generéiert. All dës widderhuelend Eenheeten, oder Planzeknäppchen, enthält Internoden a lateral Organer un de Knäppchen, an axillär Meristemen an den Blatachsen1. D'Wuesstum an d'Organisatioun vun de Planzeknäppchen ännert sech während der Entwécklung. Bei Arabidopsis gëtt d'Internodalwuesstum während der vegetativer Phas ënnerdréckt, an axillär Meristemen bleiwen an den Achselen vun de Rosettenblieder dormant. Wärend dem Iwwergank an d'Blummenphase gëtt de SAM zum Bléiestännmeristem, wouduerch verlängert Internoden an axillär Knospen, Branchen an den Achselen vun de Stäublieder a spéider blatlos Blummen2 generéiert ginn. Obwuel mir bedeitend Fortschrëtter gemaach hunn am Versteesdemech vun de Mechanismen, déi d'Initiatioun vu Blieder, Blummen a Branchen kontrolléieren, ass relativ wéineg bekannt iwwer wéi Internoden entstinn.
D'Verständnis vun der raumzäitlecher Verdeelung vun GAs hëlleft, d'Funktioune vun dësen Hormonen a verschiddene Gewëss a verschiddenen Entwécklungsstadien besser ze verstoen. D'Visualiséierung vun der Degradatioun vun der RGA-GFP-Fusioun, déi ënner der Aktioun vu sengem eegene Promotor expriméiert gëtt, liwwert wichteg Informatiounen iwwer d'Reguléierung vun den gesamten GA-Niveauen an de Wuerzelen15,16. D'RGA-Expressioun variéiert awer tëscht de Gewëss17 a gëtt vum GA18 reguléiert. Dofir kann déi differenziell Expressioun vum RGA-Promotor zum Fluoreszenzmuster féieren, dat mat RGA-GFP observéiert gëtt, an dofir ass dës Method net quantitativ. Méi rezent huet bioaktiv Fluorescein (Fl)-markéiert GA19,20 d'Akkumulatioun vu GA am Wuerzelendokortex an d'Reguléierung vu senge Zellniveauen duerch GA-Transport opgedeckt. Rezent huet de GA FRET-Sensor nlsGPS1 gewisen, datt d'GA-Niveauen mat der Zellverlängerung a Wuerzelen, Filamenter an donkelwuessene Hypokotylen21 korreléieren. Wéi mir awer gesinn hunn, ass d'GA-Konzentratioun net deen eenzege Parameter, deen d'GA-Signalaktivitéit kontrolléiert, well se vun komplexe Sensorprozesser ofhänkt. Hei, baséierend op eisem Verständnis vun den DELLA- a GA-Signalweeër, bericht mir iwwer d'Entwécklung a Charakteriséierung vun engem degradatiounsbaséierte ratiometrische Biosensor fir GA-Signalgebung. Fir dëse quantitative Biosensor z'entwéckelen, hu mir en mutanten GA-sensitiven RGA benotzt, deen mat engem fluoreszenten Protein fusionéiert an ubiquitiéis an de Gewëss expriméiert gouf, souwéi en GA-onsensitiven fluoreszenten Protein. Mir weisen datt d'mutant RGA-Proteinfusiounen net mat der endogener GA-Signalgebung stéieren, wa se ubiquitiéis expriméiert ginn, an datt dëse Biosensor d'Signalaktivitéit quantifizéiere kann, déi souwuel aus dem GA-Input wéi och aus der GA-Signalveraarbechtung duerch den Detektiounsapparat mat héijer spatiotemporaler Opléisung resultéiert. Mir hunn dëse Biosensor benotzt fir d'raimlech Verdeelung vun der GA-Signalaktivitéit ze kartéieren a quantifizéieren, wéi GA d'zellulärt Verhalen an der SAM-Epidermis reguléiert. Mir weisen datt GA d'Orientéierung vun der Divisiounsebene vun SAM-Zellen tëscht den Organprimordien reguléiert, an doduerch déi kanonesch zellulär Organisatioun vum Internodus definéiert.
Schlussendlech hu mir gefrot, ob qmRGA Ännerungen an den endogenen GA-Niveauen mat Hëllef vu wuessenden Hypokotylen melle kéint. Mir hunn virdru gewisen, datt Nitrat d'Wuesstum stimuléiert andeems et d'GA-Synthese an domat den DELLA34-Ofbau erhéicht. Dofir hu mir observéiert, datt d'Hypokotyllängt a pUBQ10::qmRGA-Séimlinger, déi ënner reichlecher Nitratversuergung (10 mM NO3−) ugebaut goufen, däitlech méi laang war wéi déi a Séimlinger, déi ënner Nitratmangelbedingungen ugebaut goufen (Ergänzungsfigur 6a). Am Aklang mat der Wuesstumsantwort waren d'GA-Signaler méi héich an Hypokotylen vu Séimlinger, déi ënner 10 mM NO3−-bedingungen ugebaut goufen, wéi a Séimlinger, déi ouni Nitrat ugebaut goufen (Ergänzungsfigur 6b, c). Dofir erméiglecht qmRGA och d'Iwwerwaachung vu Verännerungen an der GA-Signalgebung, déi duerch endogen Verännerungen an der GA-Konzentratioun induzéiert ginn.
Fir ze verstoen, ob d'GA-Signalaktivitéit, déi duerch qmRGA detektéiert gëtt, vun der GA-Konzentratioun an der GA-Perceptioun ofhänkt, wéi erwaart op Basis vum Sensordesign, hu mir d'Expressioun vun den dräi GID1-Rezeptoren a vegetativen a reproduktive Gewëss analyséiert. Bei Keimlinger huet d'GID1-GUS-Reporterlinn gewisen, datt GID1a an c héich an de Kotyledonen expriméiert goufen (Fig. 3a-c). Zousätzlech goufen all dräi Rezeptoren a Blieder, laterale Wuerzelprimordien, Wuerzelspëtzten (ausser der Wuerzelkappe vu GID1b) an dem vaskuläre System expriméiert (Fig. 3a-c). Am Bléiestänn-SAM hu mir nëmme GUS-Signaler fir GID1b an 1c detektéiert (Ergänzungsfigur 7a-c). In-situ-Hybridiséierung huet dës Expressiounsmuster bestätegt a weider gewisen, datt GID1c gläichméisseg a niddrege Konzentratiounen am SAM expriméiert gouf, während GID1b eng méi héich Expressioun un der Peripherie vum SAM gewisen huet (Ergänzungsfigur 7d-l). D'pGID1b::2xmTQ2-GID1b Translatiounsfusioun huet och e graduellt Beräich vun der GID1b-Expressioun opgedeckt, vun enger gerénger oder guer kenger Expressioun am Zentrum vum SAM bis zu enger héijer Expressioun un den Organgrenzen (Ergänzungsfigur 7m). Dofir sinn d'GID1-Rezeptoren net gläichméisseg iwwer an an de Gewëss verdeelt. An spéideren Experimenter hu mir och observéiert, datt d'Iwwerexpressioun vu GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) d'Sensibilitéit vu qmRGA an Hypokotylen op extern GA-Applikatioun erhéicht huet (Figur 3d, e). Am Géigesaz dozou war d'Fluoreszenz, déi mat qd17mRGA am Hypokotyl gemooss gouf, net empfindlech op GA3-Behandlung (Figur 3f, g). Fir béid Tester goufen d'Séimlinger mat héije Konzentratioune vu GA (100 μM GA3) behandelt, fir dat séiert Verhalen vum Sensor ze bewäerten, wou d'Fäegkeet, sech un de GID1-Rezeptor ze bannen, verbessert oder verluer gaangen ass. Zesummen bestätegen dës Resultater, datt de qmRGA Biosensor eng kombinéiert Funktioun als GA- an GA-Sensor erfëllt, a suggeréieren, datt déi differenziell Expressioun vum GID1-Rezeptor d'Emissivitéit vum Sensor däitlech moduléiere kann.
Bis elo ass d'Verdeelung vun GA-Signaler am SAM nach ëmmer net kloer. Dofir hu mir qmRGA-expriméierend Planzen an de pCLV3::mCherry-NLS Stammzellreporter35 benotzt fir héichopléisend quantitativ Kaarte vun der GA-Signalaktivitéit ze berechnen, mat engem Fokus op d'L1-Schicht (Epidermis; Abb. 4a, b, kuckt Methoden an Ergänzungsmethoden), well L1 eng Schlësselroll bei der Kontroll vum SAM-Wuesstum36 spillt. Hei huet d'pCLV3::mCherry-NLS-Expressioun e fixe geometresche Referenzpunkt fir d'Analyse vun der raimlech-zäitlecher Verdeelung vun der GA-Signalaktivitéit37 geliwwert. Obwuel GA als essentiell fir d'lateral Organentwécklung4 ugesi gëtt, hu mir observéiert, datt d'GA-Signaler am Blummenprimordium (P) niddereg waren, ugefaange mam P3-Stadium (Abb. 4a, b), während jonk P1- a P2-Primordiume eng moderéiert Aktivitéit haten, ähnlech wéi déi an der zentraler Regioun (Abb. 4a, b). Eng méi héich GA-Signalaktivitéit gouf un de Grenze vum Organprimordium festgestallt, ugefaange bei P1/P2 (op de Säite vun der Grenz) a mat engem Maximum bei P4, souwéi an allen Zellen vun der peripherer Regioun tëscht de Primordien (Fig. 4a, b an Ergänzungsfigur 8a, b). Dës méi héich GA-Signalaktivitéit gouf net nëmmen an der Epidermis observéiert, mä och an der L2- an ieweschter L3-Schicht (Ergänzungsfigur 8b). D'Muster vun de GA-Signaler, déi am SAM mat qmRGA festgestallt goufen, ass och iwwer d'Zäit onverännert bliwwen (Ergänzungsfigur 8c–f, k). Obwuel de qd17mRGA-Konstrukt systematesch am SAM vun T3-Planzen aus fënnef onofhängege Linnen, déi mir am Detail charakteriséiert hunn, erofreguléiert gouf, konnten mir d'Fluoreszenzmuster analyséieren, déi mam pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP-Konstrukt kritt goufen (Ergänzungsfigur 8g–j, l). An dëser Kontrolllinn goufen nëmme kleng Ännerungen am Fluoreszenzverhältnis am SAM festgestallt, awer am SAM-Zentrum hu mir eng kloer an onerwaart Ofsenkung vum VENUS a Verbindung mat TagBFP observéiert. Dëst bestätegt, datt d'Signalmuster, dat vum qmRGA observéiert gëtt, den GA-ofhängegen Degradatioun vum mRGA-VENUS reflektéiert, awer och weist, datt qmRGA d'GA-Signalaktivitéit am Meristemzentrum iwwerschätze kann. Zesummegefaasst weisen eis Resultater e GA-Signalmuster, dat haaptsächlech d'Verdeelung vun de Primordien reflektéiert. Dës Verdeelung vun der interprimordialer Regioun (IPR) ass op déi graduell Etabléierung vun héijer GA-Signalaktivitéit tëscht dem sech entwéckelende Primordium an der zentraler Regioun zréckzeféieren, während gläichzäiteg d'GA-Signalaktivitéit am Primordium ofhëlt (Fig. 4c, d).
D'Verdeelung vun de GID1b- a GID1c-Rezeptoren (kuckt uewen) weist drop hin, datt d'differenziell Expressioun vun de GA-Rezeptoren hëlleft, d'Muster vun der GA-Signalaktivitéit am SAM ze prägen. Mir hunn eis gefrot, ob eng differenziell Akkumulatioun vu GA bedeelegt kéint sinn. Fir dës Méiglechkeet z'ënnersichen, hu mir den nlsGPS1 GA FRET Sensor21 benotzt. Eng erhéicht Aktivéierungsfrequenz gouf am SAM vun nlsGPS1 festgestallt, dee mat 10 μM GA4+7 fir 100 Minutten behandelt gouf (Ergänzungsfigur 9a-e), wat drop hiweist, datt nlsGPS1 op Ännerungen an der GA-Konzentratioun am SAM reagéiert, sou wéi et et an de Wuerzelen21 mécht. Déi raimlech Verdeelung vun der nlsGPS1-Aktivéierungsfrequenz huet relativ niddreg GA-Niveauen an de baussenzege Schichten vum SAM gewisen, awer gewisen, datt se an der Mëtt an un de Grenze vum SAM erhéicht waren (Figur 4e an Ergänzungsfigur 9a,c). Dëst weist drop hin, datt GA och am SAM mat engem raimleche Muster verdeelt ass, dat vergläichbar ass mat deem, wat duerch qmRGA gewisen gëtt. Als komplementär Approche hu mir den SAM och mat fluoreszentem GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) oder Fl eleng als negativ Kontroll behandelt. De Fl-Signal war iwwer den SAM verdeelt, inklusiv der zentraler Regioun an dem Primordium, obwuel mat enger méi niddreger Intensitéit (Fig. 4j an Ergänzungsfigur 10d). Am Géigesaz dozou hunn sech all dräi GA-Fl spezifesch bannent de Primordiumgrenzen an a verschiddenem Grad am Rescht vum IPR gesammelt, woubäi GA7-Fl sech am gréissten Domän am IPR gesammelt huet (Fig. 4k an Ergänzungsfigur 10a,b). D'Quantifizéierung vun der Fluoreszenzintensitéit huet gewisen, datt de Verhältnis vun IPR zu net-IPR Intensitéit am GA-Fl-behandelten SAM méi héich war wéi am Fl-behandelten SAM (Fig. 4l an Ergänzungsfigur 10c). Zesumme suggeréieren dës Resultater, datt GA a méi héije Konzentratioune an IPR-Zellen präsent ass, déi am nootste bei der Organgrenz leien. Dëst weist drop hin, datt d'Muster vun der SAM GA-Signalaktivitéit souwuel aus der differentieller Expressioun vu GA-Rezeptoren wéi och aus der differentieller Akkumulatioun vu GA an IPR-Zellen no bei den Organgrenzen resultéiert. Dofir huet eis Analyse en onerwaart spatiotemporalt Muster vun der GA-Signalgebung opgedeckt, mat enger méi niddreger Aktivitéit am Zentrum a Primordium vum SAM an enger méi héijer Aktivitéit vum IPR an der peripherer Regioun.
Fir d'Roll vun der differentieller GA-Signalaktivitéit am SAM ze verstoen, hu mir d'Korrelatioun tëscht der GA-Signalaktivitéit, der Zellexpansioun an der Zelldeelung mat Hëllef vun Echtzäit-Zäitlaf-Bildgebung vum SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS analyséiert. Wéinst der Roll vum GA an der Wuestumsreguléierung gouf eng positiv Korrelatioun mat den Zellexpansiounsparameter erwaart. Dofir hu mir als éischt d'Kaarte vun der GA-Signalaktivitéit mat Kaarte vun der Zelluewerflächenwuestumsquote (als Stellvertrieder fir d'Stäerkt vun der Zellexpansioun fir eng bestëmmt Zell a fir Duechterzellen bei der Deelung) a mat Kaarte vun der Wuestumsanisotropie verglach, déi d'Richtung vun der Zellexpansioun moosst (och hei fir eng bestëmmt Zell a fir Duechterzellen bei der Deelung benotzt; Abb. 5a,b, kuckt Methoden an Ergänzungsmethoden). Eis Kaarte vun der SAM-Zelluewerflächenwuestumsquote sinn am Aklang mat fréiere Observatiounen38,39, mat minimale Wuestumsraten um Rand a maximale Wuestumsraten an entwéckelte Blummen (Abb. 5a). D'Haaptkomponentenanalyse (PCA) huet gewisen, datt d'GA-Signalaktivitéit negativ mat der Zelluewerflächenwuestumsintensitéit korreléiert war (Figur 5c). Mir hunn och gewisen, datt d'Haaptachse vun der Variatioun, dorënner d'GA-Signal-Input an d'Wuestumsintensitéit, orthogonal zu der Richtung waren, déi duerch eng héich CLV3-Expressioun bestëmmt gouf, wat den Ausschluss vun Zellen aus dem SAM-Zentrum an de verbleiwenen Analysen confirméiert. D'Spearman-Korrelatiounsanalyse huet d'PCA-Resultater confirméiert (Figur 5d), wat drop hiweist, datt méi héich GA-Signaler am IPR net zu enger méi héijer Zell-Expansioun gefouert hunn. D'Korrelatiounsanalyse huet awer eng liicht positiv Korrelatioun tëscht der GA-Signalaktivitéit an der Wuestumsanisotropie gewisen (Figur 5c, d), wat drop hiweist, datt eng méi héich GA-Signal-Aktivitéit am IPR d'Richtung vum Zellwuesstum a méiglecherweis d'Positioun vun der Zelldeelungsfläch beaflosst.
a, b Hëtzekaarte vum mëttleren Uewerflächenwuesstum (a) a Wuestumsanisotropie (b) am SAM, gemittelt iwwer siwen onofhängeg Planzen (benotzt als Stellvertrieder fir d'Stäerkt a Richtung vun der Zellexpansioun, respektiv). c D'PCA-Analyse huet déi folgend Variabelen abegraff: GA-Signal, Uewerflächenwuesstumsintensitéit, Uewerflächenwuesstumsanisotropie a CLV3-Expressioun. D'PCA-Komponent 1 war haaptsächlech negativ mat der Uewerflächenwuesstumsintensitéit korreléiert a positiv mat dem GA-Signal korreléiert. D'PCA-Komponent 2 war haaptsächlech positiv mat der Uewerflächenwuesstumsanisotropie korreléiert a negativ mat der CLV3-Expressioun korreléiert. Prozentsätz representéieren d'Variatioun, déi vun all Komponent erkläert gëtt. d Spearman-Korrelatiounsanalyse tëscht GA-Signal, Uewerflächenwuesstumsintensitéit an Uewerflächenwuesstumsanisotropie op der Gewiefsskala ouni CZ. D'Zuel riets ass de Spearman-Rho-Wäert tëscht zwou Variabelen. Asterisken weisen Fäll un, wou d'Korrelatioun/negativ Korrelatioun héich signifikant ass. e 3D-Visualiséierung vu Col-0 SAM L1-Zellen duerch konfokal Mikroskopie. Nei Zellwänn, déi am SAM (awer net am Primordium) no 10 Stonnen geformt goufen, sinn no hire Wénkelwäerter gefierft. D'Faarfbalke gëtt an der ënneschter rechter Ecke gewisen. Den Asaz weist dat entspriechend 3D-Bild no 0 Stonnen. Den Experiment gouf zweemol mat ähnleche Resultater widderholl. f Boxdiagrammer weisen d'Zelldeelungsraten an IPR- an Net-IPR Col-0 SAM (n = 10 onofhängege Planzen). D'Mëttlinn weist de Median, an d'Këschtgrenze weisen déi 25. an 75. Perzentil un. D'Schnurres weisen déi minimal a maximal Wäerter un, déi mat der R-Software bestëmmt goufen. P-Wäerter goufe mam Welch-zweisäitegen t-Test kritt. g, h Schematescht Diagramm, dat weist (g), wéi de Wénkel vun der neier Zellwand (Magenta) am Verhältnes zu der radialer Richtung vum Zentrum vum SAM gemooss gëtt (wäiss gepunktelt Linn) (nëmme spitz Wénkelwäerter, dh 0–90°, ginn berücksichtegt), an (h) déi zirkumferentiell/lateral a radial Richtungen am Meristem. i Frequenzhistogrammer vun der Zelldeelungsplangorientéierung iwwer den SAM (donkelblo), IPR (mëttelblo) an Net-IPR (hellblo). P-Wäerter goufen duerch en zweesäitege Kolmogorov-Smirnov-Test kritt. Den Experiment gouf zweemol mat ähnleche Resultater widderholl. j Frequenzhistogrammer vun der Zelldeelungsplangorientéierung vum IPR ronderëm P3 (hellgréng), P4 (mëttelgréng) a P5 (donkelgréng). P-Wäerter goufen duerch en zweesäitege Kolmogorov-Smirnov-Test kritt. Den Experiment gouf zweemol mat ähnleche Resultater widderholl.
Dofir hu mir als nächst d'Korrelatioun tëscht GA-Signalgebung an der Zelldeelungsaktivitéit ënnersicht, andeems mir nei geformt Zellwänn während dem Assay identifizéiert hunn (Fig. 5e). Dësen Usaz huet et eis erméiglecht, d'Frequenz an d'Richtung vun der Zelldeelung ze moossen. Iwwerraschenderweis hu mir festgestallt, datt d'Frequenz vun den Zelldeelungen am IPR an am Rescht vum SAM (Net-IPR, Fig. 5f) ähnlech war, wat drop hiweist, datt Ënnerscheeder an der GA-Signalgebung tëscht IPR- an Net-IPR-Zellen d'Zelldeelung net signifikant beaflossen. Dëst, an déi positiv Korrelatioun tëscht GA-Signalgebung an der Wuestumsanisotropie, hunn eis dozou bruecht ze iwwerleeën, ob d'GA-Signalaktivitéit d'Orientéierung vun der Zelldeelungsfläch beaflosse kéint. Mir hunn d'Orientéierung vun der neier Zellmauer als spitzen Wénkel relativ zu der Radialachs gemooss, déi de Meristemzentrum an d'Mëtt vun der neier Zellmauer verbënnt (Fig. 5e-i) an eng kloer Tendenz vun den Zellen observéiert, sech a Wénkelen no bei 90° relativ zu der Radialachs ze deelen, mat den héchste Frequenzen bei 70–80° (23,28%) an 80–90° (22,62%) (Fig. 5e,i), wat den Zelldeelungen an der zirkumferentialer/transversaler Richtung entsprécht (Fig. 5h). Fir de Bäitrag vum GA-Signal zu dësem Zelldeelungsverhalen z'ënnersichen, hu mir d'Zelldeelungsparameter am IPR an am Net-IPR separat analyséiert (Fig. 5i). Mir hunn observéiert, datt d'Divisiounswénkelverdeelung an IPR-Zellen sech vun där an Net-IPR-Zellen oder an Zellen am ganze SAM ënnerscheet huet, woubäi IPR-Zellen en héiere Prozentsaz u lateralen/kreesfërmegen Zelldeelungen opgewisen hunn, dh 70–80° an 80–90° (33,86% respektiv 30,71%, entspriechend Proportiounen) (Fig. 5i). Dofir hunn eis Observatiounen eng Associatioun tëscht héijer GA-Signalgebung an enger Zelldeelungsplangorientéierung no bei der Ëmlafrichtung opgedeckt, ähnlech wéi d'Korrelatioun tëscht GA-Signalaktivitéit a Wuestumsanisotropie (Fig. 5c, d). Fir d'räumlech Erhaalung vun dëser Associatioun weider ze etabléieren, hu mir d'Divisiounsplangorientéierung an IPR-Zellen ronderëm de Primordium gemooss, ugefaange vu P3, well déi héchst GA-Signalaktivitéit an dëser Regioun ugefaange vu P4 detektéiert gouf (Fig. 4). D'Divisiounswénkelen vum IPR ronderëm P3 a P4 hunn keng statesch signifikant Ënnerscheeder gewisen, obwuel eng erhéicht Frequenz vu lateralen Zelldeelungen am IPR ronderëm P4 observéiert gouf (Fig. 5j). Wéi och ëmmer, an den IPR-Zellen ronderëm P5 ass den Ënnerscheed an der Orientéierung vun der Zelldeelungsfläch statesch signifikant ginn, mat enger staarker Erhéijung vun der Frequenz vun transversalen Zelldeelungen (Fig. 5j). Zesumme suggeréieren dës Resultater, datt d'GA-Signalgebung d'Orientéierung vun Zelldeelungen am SAM kontrolléiere kann, wat mat fréiere Berichter40,41 iwwereneestëmmt, datt eng héich GA-Signalgebung eng lateral Orientéierung vun Zelldeelungen am IPR induzéiere kann.
Et gëtt virausgesot, datt Zellen am IPR net an d'Primordien, mä éischter an d'Internoden integréiert ginn2,42,43. Déi transversal Orientéierung vun den Zelldeelungen am IPR kéint zu der typescher Organisatioun vu parallele Längsreihen vun Epidermalzellen an den Internoden féieren. Eis uewe beschriwwen Observatioune suggeréieren, datt d'GA-Signalgebung wahrscheinlech eng Roll an dësem Prozess spillt, andeems se d'Richtung vun der Zelldeelung reguléiert.
De Verloscht vun der Funktioun vu verschiddene DELLA-Genen féiert zu enger konstitutiver GA-Äntwert, an Dell-Mutanten kënne benotzt ginn, fir dës Hypothese ze testen44. Mir hunn als éischt d'Expressiounsmuster vu fënnef DELLA-Genen am SAM analyséiert. Transkriptiounsfusioun vun der GUS-Linn45 huet gewisen, datt GAI, RGA, RGL1 an RGL2 (an engem vill manneren Ausmooss) am SAM expriméiert goufen (Ergänzungsfigur 11a-d). In-situ-Hybridiséierung huet weider gewisen, datt GAI mRNA spezifesch a Primordien a Blummen an Entwécklung accumuléiert (Ergänzungsfigur 11e). RGL1- an RGL3-mRNA goufen am ganze SAM-Dachdach an an eelere Blummen detektéiert, während RGL2-mRNA méi reichlech an der Grenzregioun war (Ergänzungsfigur 11f-h). Konfokal Bildgebung vum pRGL3::RGL3-GFP SAM huet d'Expressioun bestätegt, déi duerch In-situ-Hybridiséierung observéiert gouf, a gewisen, datt d'RGL3-Protein am zentralen Deel vum SAM accumuléiert (Ergänzungsfigur 11i). Mat Hëllef vun der pRGA::GFP-RGA Linn hu mir och festgestallt, datt RGA Protein sech am SAM accumuléiert, awer seng Heefegkeet un der Grenz ab P4 hëlt of (Ergänzungsfigur 11j). Bemierkenswäert ass, datt d'Expressiounsmuster vun RGL3 an RGA mat enger méi héijer GA-Signalaktivitéit am IPR konsequent sinn, wéi duerch qmRGA festgestallt gouf (Figur 4). Ausserdeem weisen dës Donnéeën drop hin, datt all DELLAs am SAM expriméiert ginn an datt hir Expressioun kollektiv de ganze SAM ëmfaasst.
Mir hunn duerno d'Zelldeelungsparameter am Wildtyp SAM (Ler, Kontroll) an de gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della Quintuple (global) Mutanten analyséiert (Fig. 6a, b). Interessanterweis hu mir eng statesch signifikant Verrécklung an der Verdeelung vun den Zelldeelungswénkelfrequenzen am della global Mutant SAM am Verglach zum Wildtyp observéiert (Fig. 6c). Dës Ännerung beim della global Mutant war op eng Erhéijung vun der Frequenz vun 80–90° Wénkelen (34,71% vs. 24,55%) an, a mannerem Mooss, 70–80° Wénkelen (23,78% vs. 20,18%) zeréckzeféieren, dat heescht, wat transversal Zelldeelungen entsprécht (Fig. 6c). D'Frequenz vun net-transversalen Deelungen (0–60°) war och méi niddreg beim della global Mutant (Fig. 6c). D'Frequenz vun transversalen Zelldeelungen war am SAM vum della global Mutant signifikant erhéicht (Fig. 6b). D'Frequenz vun transversalen Zelldeelungen am IPR war och méi héich beim della global Mutant am Verglach zum Wildtyp (Fig. 6d). Baussent der IPR-Regioun hat de Wildtyp eng méi gläichméisseg Verdeelung vun den Zelldeelungswénkelen, während den della global Mutant tangential Deelungen wéi den IPR bevorzugt huet (Fig. 6e). Mir hunn och d'Orientéierung vun den Zelldeelungen am SAM vun de ga2-Oxidase (ga2ox) Fënnefmolmutanten (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, a ga2ox6-2) quantifizéiert, en GA-inaktiven Mutantenhannergrond, an deem GA sech accumuléiert. Am Aklang mat der Erhéijung vun den GA-Niveauen war den SAM vun der quintuple ga2ox Mutant Bléiestänn méi grouss wéi dee vum Col-0 (Ergänzungsfigur 12a, b), an am Verglach zum Col-0 huet de quintuple ga2ox SAM eng däitlech aner Verdeelung vun den Zelldeelungswénkelen gewisen, woubäi d'Wénkelfrequenz vun 50° op 90° eropgaangen ass, dat heescht erëm tangential Deelungen favoriséiert (Ergänzungsfigur 12a-c). Sou weisen mir, datt déi konstitutiv Aktivéierung vun der GA-Signalgebung an d'GA-Akkumulatioun lateral Zelldeelungen am IPR an am Rescht vum SAM induzéieren.
a, b 3D-Visualiséierung vun der L1-Schicht vum PI-gefierften Ler (a) a globalem della-Mutant (b) SAM mat Hëllef vu konfokaler Mikroskopie. Nei Zellwänn, déi am SAM (awer net am Primordium) iwwer eng Period vun 10 Stonnen geformt goufen, ginn ugewisen a gefierft no hire Wénkelwäerter. Den Asaz weist den SAM bei 0 Stonnen. D'Faarfbalke gëtt an der ënneschter rechter Ecke ugewisen. De Pfeil an (b) weist op e Beispill vun ausgeriichten Zelldateien am globale della-Mutant. Den Experiment gouf zweemol mat ähnleche Resultater widderholl. ce Verglach vun der Frequenzverdeelung vun den Zelldeelungsplangorientéierungen am ganze SAM (d), IPR (e) an net-IPR (f) tëscht Ler a globalem della. P-Wäerter goufen mat engem zweesäitege Kolmogorov-Smirnov-Test kritt. f, g 3D-Visualiséierung vu konfokale Biller vum PI-gefierften SAM vu Col-0 (i) an pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgenen Planzen. D'Paneele (a, b) weisen nei Zellwänn (awer net Primordien), déi bannent 10 Stonnen am SAM geformt goufen. Den Experiment gouf zweemol mat ähnleche Resultater widderholl. h–j Vergläich vun der Frequenzverdeelung vun den Orientéierunge vun der Zelldeelungsfläch, déi am ganze SAM (h), IPR (i) an Net-IPR (j) tëscht Col-0- a pCUC2::gai-1-VENUS-Planzen lokaliséiert sinn. P-Wäerter goufen mat engem zweesäitege Kolmogorov-Smirnov-Test kritt.
Mir hunn duerno den Effekt vun der Hemmung vun der GA-Signalgebung spezifesch am IPR getest. Zu dësem Zweck hu mir de Cotyledon Cup 2 (CUC2) Promotor benotzt fir d'Expressioun vun engem dominante negativen gai-1 Protein, dat mat VENUS fusionéiert ass (an der pCUC2::gai-1-VENUS Linn), ze steieren. Am Wildtyp SAM steiert de CUC2 Promotor d'Expressioun vun de meeschten IPRs am SAM, dorënner Grenzzellen, vu P4 un, an eng ähnlech spezifesch Expressioun gouf a pCUC2::gai-1-VENUS Planzen observéiert (kuckt ënnen). D'Verdeelung vun den Zelldeelungswénkelen iwwer den SAM oder IPR vu pCUC2::gai-1-VENUS Planzen war net signifikant anescht wéi déi vum Wildtyp, obwuel mir onerwaart festgestallt hunn, datt Zellen ouni en IPR an dëse Planzen sech mat enger méi héijer Frequenz vun 80-90° gedeelt hunn (Fig. 6f-j).
Et gouf virgeschloen, datt d'Richtung vun der Zelldeelung vun der Geometrie vum SAM ofhänkt, besonnesch vun der Zugspannung, déi duerch d'Gewebskrümmung generéiert gëtt46. Mir hunn dofir gefrot, ob d'Form vum SAM an der della global Mutant- a pCUC2::gai-1-VENUS-Planz geännert gouf. Wéi virdru bericht12, war d'Gréisst vum della global Mutant-SAM méi grouss wéi déi vum Wildtyp (Ergänzungsfigur 13a, b, d). D'In-situ-Hybridiséierung vu CLV3 an STM RNA huet d'Meristem-Expansioun an della-Mutanten bestätegt a weider d'lateral Expansioun vun der Stammzellnisch gewisen (Ergänzungsfigur 13e, f, h, i). Wéi och ëmmer, d'SAM-Krümmung war a béide Genotypen ähnlech (Ergänzungsfigur 13k, m, n, p). Mir hunn eng ähnlech Gréisstzounahm beim gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della Quadruple Mutant ouni Ännerung vun der Krümmung am Verglach zum Wildtyp observéiert (Ergänzungsfigur 13c, d, g, j, l, o, p). D'Frequenz vun der Zelldeelungsorientéierung war och beim della-Quadruple-Mutant beaflosst, awer a mannerem Mooss wéi beim della-monolithesche Mutant (Ergänzungsfigur 12d-f). Dësen Dosiseffekt, zesumme mam Manktem un engem Effekt op d'Krümmung, weist drop hin, datt déi reschtlech RGL3-Aktivitéit beim Della-Quadruple-Mutant d'Ännerungen an der Zelldeelungsorientéierung limitéiert, déi duerch de Verloscht vun der DELLA-Aktivitéit verursaacht ginn, an datt Ännerungen an de lateralen Zelldeelungen als Äntwert op Ännerungen an der GA-Signalaktivitéit optrieden anstatt op Ännerungen an der SAM-Geometrie. Wéi uewe beschriwwen, dréit de CUC2-Promoter d'IPR-Expressioun am SAM un, ugefaange bei P4 (Ergänzungsfigur 14a, b), an am Géigesaz dozou hat de pCUC2::gai-1-VENUS SAM eng reduzéiert Gréisst, awer eng méi héich Krümmung (Ergänzungsfigur 14c-h). Dës Ännerung an der pCUC2::gai-1-VENUS SAM-Morphologie kann zu enger anerer Verdeelung vu mechanesche Spannungen am Verglach zum Wildtyp féieren, bei deem héich zirkumferenziell Spannungen op enger méi kuerzer Distanz vum SAM-Zentrum ufänken47. Alternativ kënnen d'Ännerungen an der Morphologie vu pCUC2::gai-1-VENUS SAM duerch Ännerungen an de regionale mechanesche Eegeschafte resultéieren, déi duerch d'Transgenexpression induzéiert ginn48. An zwou Fäll kéint dëst d'Effekter vun de Verännerungen an der GA-Signalgebung deelweis ausgläichen, andeems d'Wahrscheinlechkeet erhéicht gëtt, datt d'Zellen sech an der zirkumferenzieller/transversaler Orientéierung deelen, wat eis Observatiounen erkläert.
Zesummegeholl bestätegen eis Donnéeën, datt eng méi héich GA-Signalgebung eng aktiv Roll an der lateraler Orientéierung vun der Zelldeelungsfläch am IPR spillt. Si weisen och, datt d'Meristemkrümmung och d'Orientéierung vun der Zelldeelungsfläch am IPR beaflosst.
Déi transversal Orientéierung vun der Divisiounsfläch am IPR, wéinst der héijer GA-Signalaktivitéit, weist drop hin, datt GA eng radial Zelldatei an der Epidermis am SAM virorganiséiert, fir déi zellulär Organisatioun ze definéieren, déi spéider am epidermalen Internod fonnt gëtt. Tatsächlech waren esou Zelldateien dacks a SAM-Biller vun della global Mutanten ze gesinn (Fig. 6b). Fir d'Entwécklungsfunktioun vum raimleche Muster vun der GA-Signalgebung am SAM weider z'ënnersichen, hu mir Zäitlafbildgebung benotzt fir déi raimlech Organisatioun vun Zellen am IPR a Wildtyp- (Ler a Col-0), della global Mutanten a pCUC2::gai-1-VENUS transgenen Planzen z'analyséieren.
Mir hunn festgestallt, datt qmRGA gewisen huet, datt d'GA-Signalaktivitéit am IPR vun P1/P2 zougeholl huet an e Maximum bei P4 erreecht huet, an dëst Muster ass iwwer d'Zäit konstant bliwwen (Fig. 4a-f an Ergänzungsfigur 8c-f, k). Fir d'raimlech Organisatioun vun Zellen am IPR mat zouhuelendem GA-Signal z'analyséieren, hu mir Ler IPR-Zellen iwwer an op de Säite vu P4 no hirem Entwécklungsschicksal markéiert, dat 34 Stonnen no der éischter Observatioun analyséiert gouf, also méi wéi zwou Plastidzäiten, wat eis erlaabt huet, d'IPR-Zellen während der Primordiumentwécklung vu P1/P2 bis P4 ze verfollegen. Mir hunn dräi verschidde Faarwen benotzt: giel fir déi Zellen, déi am Primordium no bei P4 integréiert waren, gréng fir déi, déi am IPR waren, a violett fir déi, déi un deenen zwou Prozesser deelgeholl hunn (Fig. 7a-c). Bei t0 (0 Stonnen) waren 1-2 Schichten vun IPR-Zellen virum P4 sichtbar (Fig. 7a). Wéi erwaart, hunn dës Zellen, wéi se sech gedeelt hunn, dat haaptsächlech iwwer d'transversal Divisiounsebene gemaach (Fig. 7a-c). Ähnlech Resultater goufen mat Col-0 SAM kritt (mat Fokus op P3, deem seng Grenz sech ähnlech wéi P4 bei Ler falt), obwuel an dësem Genotyp d'Falt, déi um Blummenrand geformt gouf, d'IPR-Zellen méi séier verstoppt huet (Fig. 7g–i). Dofir organiséiert den Deelungsmuster vun den IPR-Zellen d'Zellen a radial Reien, wéi an Internoden. D'Organisatioun vun de radiale Reien an d'Lokalisatioun vun den IPR-Zellen tëscht hannereneen Organer suggeréieren, datt dës Zellen internodal Virleefer sinn.
Hei hu mir e ratiometrische GA-Signal-Biosensor, qmRGA, entwéckelt, deen d'quantitativ Kartierung vun der GA-Signal-Aktivitéit erméiglecht, déi aus kombinéierte GA- a GA-Rezeptor-Konzentratiounen resultéiert, wärend d'Interferenz mat endogene Signalweeër miniméiert gëtt, wouduerch Informatiounen iwwer d'GA-Funktioun op zellulärem Niveau geliwwert ginn. Zu dësem Zweck hu mir e modifizéierten DELLA-Protein, mRGA, konstruéiert, dat d'Fäegkeet verluer huet, DELLA-Interaktiounspartner ze bannen, awer nach ëmmer empfindlech op GA-induzéiert Proteolyse reagéiert. qmRGA reagéiert souwuel op exogen wéi och endogen Ännerungen an den GA-Niveauen, a seng dynamesch Sensoreegeschafte erméiglechen d'Bewäertung vu spatiotemporalen Ännerungen an der GA-Signal-Aktivitéit während der Entwécklung. qmRGA ass och e ganz flexibles Instrument, well et un ënnerschiddlech Gewëss ugepasst ka ginn, andeems de Promotor, deen fir seng Expressioun benotzt gëtt, geännert gëtt (wann néideg), an duerch déi konservéiert Natur vum GA-Signalwee an dem PFYRE-Motiv iwwer Angiospermen ass et wahrscheinlech, datt et op aner Aarte transferéiert ka ginn22. Am Aklang domat gouf gewisen, datt eng gläichwäerteg Mutatioun am Räis-SLR1 DELLA-Protein (HYY497AAA) och d'Wuesstumsrepressoraktivitéit vum SLR1 ënnerdréckt, während se säin GA-vermittelten Ofbau nëmme liicht reduzéiert, ähnlech wéi mRGA23. Bemierkenswäert ass, datt rezent Studien an Arabidopsis gewisen hunn, datt eng eenzeg Aminosäuremutatioun am PFYRE-Domän (S474L) d'Transkriptiounsaktivitéit vum RGA verännert huet, ouni seng Fäegkeet ze beaflossen, mat Transkriptiounsfaktorpartner ze interagéieren50. Och wann dës Mutatioun ganz no un den 3 Aminosäuresubstitutiounen ass, déi am mRGA präsent sinn, weisen eis Studien, datt dës zwou Mutatiounen déi verschidde Charakteristike vum DELLA veränneren. Och wann déi meescht Transkriptiounsfaktorpartner un d'LHR1- an SAW-Domänen vum DELLA26,51 binden, kënnen e puer konservéiert Aminosäuren am PFYRE-Domän hëllefen, dës Interaktiounen ze stabiliséieren.
D'Entwécklung vun Internoden ass e Schlësselmerkmal an der Planzenarchitektur an der Verbesserung vum Ertrag. qmRGA huet eng méi héich GA-Signalaktivitéit an den IPR-Internoden-Progenitorzellen opgedeckt. Duerch d'Kombinatioun vu quantitativer Bildgebung a Genetik hu mir gewisen, datt GA-Signalmuster kreesfërmeg/transversal Zelldeelungsflächen an der SAM-Epidermis iwwerlageren an doduerch d'Zelldeelungsorganisatioun formen, déi fir d'Entwécklung vun Internoden erfuerderlech ass. Verschidde Reguléierer vun der Zelldeelungsorientéierung goufen während der Entwécklung identifizéiert52,53. Eis Aarbecht bitt e kloert Beispill dofir, wéi d'GA-Signalaktivitéit dëse Zellparameter reguléiert. DELLA kann mat virfaltege Proteinkomplexer41 interagéieren, sou datt d'GA-Signaliséierung d'Orientéierung vun der Zelldeelungsfläch reguléiere kann, andeems se direkt d'Orientéierung vun de kortikale Mikrotubuli beaflosst40,41,54,55. Mir hunn onerwaart gewisen, datt am SAM de Korrelat vun der méi héijer GA-Signalaktivitéit net d'Zellverlängerung oder -deelung war, mä nëmmen d'Wuesstumsanisotropie, wat mat engem direkten Effekt vu GA op d'Richtung vun der Zelldeelung am IPR konsequent ass. Mir kënnen awer net ausschléissen, datt dësen Effekt och indirekt kéint sinn, zum Beispill duerch GA-induzéiert Zellwanderweichung56 vermittelt. Ännerungen an den Eegeschafte vun der Zellwand verursaachen mechanesch Belaaschtung57,58, déi och d'Orientéierung vun der Zelldeelungsfläch beaflosse kann, andeems se d'Orientéierung vu kortikale Mikrotubuli beaflossen39,46,59. Déi kombinéiert Effekter vum GA-induzéierte mechanesche Belaaschtung an der direkter Reguléierung vun der Mikrotubuli-Orientéierung duerch GA kéinten un der Generéierung vun engem spezifesche Muster vun der Zelldeelungsorientéierung am IPR bedeelegt sinn, fir Internoden ze definéieren, a weider Studien sinn néideg fir dës Iddi ze testen. Ähnlech hunn fréier Studien d'Wichtegkeet vun den DELLA-interagéierende Proteinen TCP14 an 15 bei der Kontroll vun der Internodenbildung60,61 ervirgehuewen an dës Faktoren kéinten d'Aktioun vu GA zesumme mat BREVIPEDICELLUS (BP) a PENNYWISE (PNY) vermëttelen, déi d'Internodenentwécklung reguléieren a gewisen hunn, datt se d'GA-Signalgebung beaflossen2,62. Well DELLAe mat Brassinosteroid-, Ethylen-, Jasmonsäure- an Abscisinsäure- (ABA)-Signalweeër63,64 interagéieren an dës Hormone d'Orientéierung vun de Mikrotubuli65 beaflosse kënnen, kënnen d'Effekter vu GA op d'Orientéierung vun der Zelldeelung och duerch aner Hormone vermittelt ginn.
Fréi zytologesch Studien hunn gewisen, datt souwuel déi bannenzeg wéi och déi baussenzeg Regioun vum Arabidopsis SAM fir d'Internodenentwécklung noutwendeg sinn2,42. D'Tatsaach, datt GA aktiv d'Zelldeelung an den bannenzege Gewëss12 reguléiert, ënnerstëtzt eng duebel Funktioun vum GA bei der Reguléierung vum Meristem an der Internodengréisst am SAM. D'Muster vun der direkter Zelldeelung ass och am bannenzege SAM-Gewëss enk geregelt, an dës Reguléierung ass essentiell fir de Stammwuesstum52. Et wäert interessant sinn ze ënnersichen, ob GA och eng Roll bei der Orientéierung vun der Zelldeelungsfläch an der bannenzeger SAM-Organisatioun spillt, wouduerch d'Spezifikatioun an d'Entwécklung vun Internoden am SAM synchroniséiert gëtt.
D'Planze goufen in vitro a Buedem oder 1x Murashige-Skoog (MS) Medium (Duchefa) ergänzt mat 1% Saccharose an 1% Agar (Sigma) ënner Standardbedingungen (16 Stonne Liicht, 22 °C) ugebaut, ausser fir Hypokotyl- a Wuerzelwuesstemsexperimenter, bei deenen d'Séimlinger op vertikale Placken ënner konstantem Liicht an 22 °C ugebaut goufen. Fir Nitratexperimenter goufen d'Planzen op modifizéiertem MS-Medium (bioWORLD Planzemedium) ergänzt mat ausreechendem Nitrat (0 oder 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-Succinat, 1% Saccharose an 1% A-Agar (Sigma) ënner laangen Dagbedingungen ugebaut.
GID1a cDNA, déi an pDONR221 agefouert gouf, gouf mat pDONR P4-P1R-pUBQ10 a pDONR P2R-P3-mCherry a pB7m34GW rekombinéiert fir pUBQ10::GID1a-mCherry ze generéieren. IDD2 DNA, déi an pDONR221 agefouert gouf, gouf a pB7RWG266 rekombinéiert fir p35S:IDD2-RFP ze generéieren. Fir pGID1b::2xmTQ2-GID1b ze generéieren, goufen e 3,9 kb Fragment virum GID1b-Codéierungsberäich an e 4,7 kb Fragment, dat d'GID1b cDNA (1,3 kb) an den Terminator (3,4 kb) enthält, fir d'éischt mat de Primeren an der Ergänzungstabell 3 amplifizéiert an duerno a pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) respektiv pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) agefouert, a schliisslech mat pDONR221 2xmTQ268 an den pGreen 012567 Zilvektor mat Hëllef vu Gateway-Klonéierung rekombinéiert. Fir pCUC2::LSSmOrange ze generéieren, goufen d'CUC2-Promotorsequenz (3229 bp virun ATG), gefollegt vun der Codéierungssequenz vu groussem Stokes-verschiebtem mOrange (LSSmOrange)69 mam N7-Nuklearlokaliséierungssignal an dem NOS-Transkriptiounsterminator, an de pGreen Kanamycin-Targetingvektor zesummegesat andeems de Gateway 3-Fragment-Rekombinatiounssystem (Invitrogen) benotzt gouf. De binäre Vektor vu Planzen gouf an den Agrobacterium tumefaciens-Stamm GV3101 agefouert an an d'Blieder vum Nicotiana benthamiana mat der Agrobacterium-Infiltratiounsmethod an an d'Arabidopsis thaliana Col-0 mat der Blummendëppmethod agefouert. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry a pCLV3::mCherry-NLS qmRGA goufen aus den F3- an F1-Nokommen vun de jeeweilege Kräizungen isoléiert.
RNA In situ Hybridiséierung gouf op ongeféier 1 cm laange Sprossspëtzen72 duerchgefouert, déi gesammelt an direkt an enger FAA-Léisung (3,7% Formaldehyd, 5% Essigsäure, 50% Ethanol) fixéiert goufen, déi op 4 °C virgekillt war. No 2 × 15 Minutte Vakuumbehandlungen gouf de Fixativ gewiesselt an d'Prouwe goufen iwwer Nuecht inkubéiert. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 an RGL3 cDNAs an Antisense-Sonden zu hiren 3'-UTRs goufen mat de Primeren synthetiséiert, déi an der Ergänzungstabell 3 gewisen sinn, wéi vum Rosier et al.73 beschriwwen. Digoxigenin-markéiert Sonden goufen immunodetektéiert mat Digoxigenin-Antikörper (3000-fach Verdënnung; Roche, Katalognummer: 11 093 274 910), an d'Schnëtter goufen mat enger 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat (BCIP, 250-fach Verdënnung)/Nitroblo-Tetrazolium (NBT, 200-fach Verdënnung) Léisung gefierft.
Zäitpunkt vun der Verëffentlechung: 10. Februar 2025