D'Anthelmintik Medikament N,N-diethyl-m-toluamid (DEET) gouf gemellt fir AChE (Acetylcholinesterase) ze hemmen an huet potenziell karzinogene Eegeschafte wéinst exzessive Vasculariséierung. An dësem Pabeier weisen mir datt DEET spezifesch Endothelzellen stimuléiert déi Angiogenese förderen, an doduerch den Tumorwachstum erhéijen. DEET aktivéiert cellulär Prozesser déi zu Angiogenese féieren, dorënner Prolifératioun, Migratioun an Adhäsioun. Dëst ass mat enger verstäerkter NO Produktioun a VEGF Ausdrock an Endothelzellen assoziéiert. Silencing vu M3 oder Benotzung vun pharmakologeschen M3 Inhibitoren hunn all dës Effekter ofgeschaaft, wat suggeréiert datt DEET-induzéiert Angiogenese M3-sensibel ass. Experimenter mat Kalziumsignaléierung an Endothelial- an HEK Zellen, déi M3 Rezeptoren iwwerausdrécken, souwéi Bindungs- an Dockingstudien, weisen datt DEET als allosteresche Modulator vu M3 Rezeptoren handelt. Ausserdeem hemmt DEET AChE, doduerch d'Bioverfügbarkeet vun Acetylcholin a seng Bindung un M3 Rezeptoren erhéicht, a proangiogen Effekter duerch allosteresch Reguléierung verbessert.
Primär ECs goufen aus der Aorta vu Schwäizer Mais isoléiert. D'Extraktiounsmethod gouf vum Kobayashi Protokoll 26 adaptéiert. Murine ECs goufen an EBM-2 Medium kultivéiert, ergänzt mat 5% Hëtzt-inaktivéiert FBS bis zum véierte Passage.
Den Effet vun zwou Konzentratioune vun DEET op d'Prolifératioun vun HUVEC, U87MG, oder BF16F10 war mat der CyQUANT Zell Prolifératioun Assay Kit (Molecular Probes, C7026) analyséiert. Kuerz gesot, 5.103 Zellen pro Well goufen an enger 96-Well Plack gesaat, erlaabt iwwer Nuecht ze befestigen, an duerno mat DEET fir 24 h behandelt. Nodeems Dir de Wuesstumsmedium ofgeschaaft hutt, füügt d'Faarfverbindungsléisung un all Brunn vun der Mikroplate an inkubéiert d'Zellen bei 37 ° C fir 30 min. Fluoreszenzniveau goufe mat engem Mithras LB940 Multimode Mikroplate Lieser (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Däitschland) mat 485 nm Excitatiounsfilter a 530 nm Emissiounsfilter ausgestatt.
HUVEC goufen an 96-gutt Placke bei enger Dicht vun 104 Zellen pro gutt gesaat. Zellen goufen mat DEET fir 24 h behandelt. Zell Viabilitéit gouf mat engem colorimetric MTT Assay (Sigma-Aldrich, M5655) bewäert. Optesch Dichtwäerter goufen op engem Multimode Mikroplate Lieser (Mithras LB940) bei enger Wellelängt vu 570 nm kritt.
D'Effekter vum DEET goufen studéiert mat In vitro Angiogenesis Assays. D'Behandlung mat 10-8 M oder 10-5 M DEET erhéicht d'Bildung vu Kapillarlängt an HUVECs (Figebam. 1a, b, wäiss Baren). Am Verglach mat der Kontroll Grupp, Behandlung mat DEET Konzentratioune rangéiert vun 10-14 bis 10-5 M gewisen, datt d'capillary Längt e Plateau op 10-8 M DEET erreecht (Ergänzlech Lalumi S2). Kee groussen Ënnerscheed gouf am in vitro proangiogenic Effekt vun HUVECs mat DEET behandelt an der Konzentratiounsberäich vun 10-8 M an 10-5 M fonnt.
Fir den Effekt vun DEET op Neovaskulariséierung ze bestëmmen, hu mir in vivo Neovaskulariséierungsstudien gemaach. No 14 Deeg, Mais injizéiert mat endothelial Zellen precultured mat 10-8 M oder 10-5 M DEET weisen eng bedeitend Erhéijung vun Hämoglobin Inhalt (Fig. 1c, wäiss Baren).
Ausserdeem gouf DEET-induzéiert Neovaskulariséierung an U87MG xenograft-tragende Mais studéiert, déi all Dag (ip) mat DEET injizéiert goufen an enger Dosis bekannt fir Plasma Konzentratioune vun 10-5 M ze induzéieren, wat normal ass bei exponéierte Mënschen. an 23. Detectable erhéijen (dh Tumoren> 100 mm3) goufen 14 Deeg no Sprëtz vun U87MG Zellen an Mais observéiert. Um Dag 28, war entholl Wuesstem bedeitend verbessert an DEET-behandelt Mais Verglach mat Kontroll Mais (Figebam. 1d, Plaze ). Ausserdeem, CD31 staining vun erhéijen huet gewisen, datt DEET däitlech capillary Beräich fräi awer net microvessel Dicht. (Fig. 1e–g).
Fir d'Roll vun muscarinesche Rezeptoren an der DETA-induzéierter Prolifératioun ze bestëmmen, gouf 10-8 M oder 10-5 M DETA an der Präsenz vu pFHHSiD (10-7 M, e selektiven M3 Rezeptor-Antagonist) benotzt. Behandlung vun HUVEC. pFHHSiD komplett blockéiert d'proliferative Eegeschafte vun DETA bei all Konzentratioune (Table 1).
Ënnert dëse Konditiounen, iwwerpréift mir och ob DEET capillary Längt an HUVEC Zellen Erhéijung géif. Ähnlech verhënnert pFHHSiD bedeitend DEET-induzéiert Kapillarlängt (Figebam. 1a, b, gro Baren). Ausserdeem goufen ähnlech Experimenter mat M3 siRNA gesuergt. Obwuel d'Kontroll siRNA net effikass war capillary Formatioun ze förderen, silencing vun der M3 muscarinic receptor ofgeschaf d'Fähegkeet vun DEET capillary Längt ze Erhéijung (Figebam. 1a, b, schwaarz Baren).
Ausserdeem, souwuel 10-8 M oder 10-5 M DEET-entschlof vascularization kënschtlech an neovascularization zu VIVO waren komplett vun pFHHSiD blockéiert (Lalumi 1c, d, Kreeser). Dës Resultater weisen datt DEET Angiogenese duerch e Wee sensibel fir selektiv M3 Rezeptor Antagonisten oder M3 siRNA fördert.
AChE ass dat molekulare Zil vum DEET. Drogen wéi Donepezil, déi als AChE Inhibitoren handelen, kënnen d'EC Angiogenese in vitro stimuléieren an a Maus hindlimb Ischämie Modeller14. Mir getest den Effet vun zwou Konzentratioune vun DEET op AChE Enzym Aktivitéit am HUVEC. Niddereg (10-8 M) an héich (10-5 M) Konzentratioune vun DEET ofgeholl endothelial AChE Aktivitéit am Verglach zu Kontroll Konditiounen (Figebam. 2).
Béid Konzentratioune vun DEET (10-8 M an 10-5 M) reduzéiert Acetylcholinesterase Aktivitéit op HUVEC. BW284c51 (10-5 M) gouf als Kontroll fir Acetylcholinesterase-Inhibitoren benotzt. D'Resultater ginn als Prozentsaz vun der AChE Aktivitéit op HUVEC ausgedréckt, déi mat den zwou Konzentratioune vun DEET behandelt ginn am Verglach mat Gefier-behandelt Zellen. Wäerter ginn als Mëttel ± SEM vu sechs onofhängegen Experimenter ausgedréckt. *p <0,05 am Verglach mat Kontroll (Kruskal-Wallis an Dunn Multiple Verglach Test).
Nitrogenoxid (NO) ass am angiogenesche Prozess 33 involvéiert, dofir gouf KENG Produktioun an DEET-stimuléierten HUVECs studéiert. DEET-behandelt endothelial NO Produktioun war am Verglach zu Kontroll Zellen erhéicht, awer erreecht Bedeitung nëmmen bei enger Dosis vun 10-8 M (Figebam. 3c). Fir d'molekulare Verännerungen ze bestëmmen déi DEET-induzéiert NO Produktioun kontrolléieren, goufen eNOS Ausdrock an Aktivatioun duerch Western Blotting analyséiert. Och wann d'DEET-Behandlung den eNOS-Ausdrock net geännert huet, huet et d'eNOS-Phosphorylatioun op senger Aktivéierungsplaz (Ser-1177) wesentlech erhéicht, wärend seng Inhibitorplaz (Thr-495) am Verglach zu onbehandelt Zellen an der eNOS Phosphorylatioun (Fig. 3d). Ausserdeem gouf d'Verhältnis vu phosphoryléierten eNOS op der Aktivéierungsplaz an der Hemmungsplaz berechent nodeems d'Quantitéit vu phosphoryléierten eNOS zum Gesamtbetrag vun Enzym normaliséiert gouf. Dëst Verhältnis war bedeitend erhéicht an HUVECs mat all Konzentratioun vun DEET behandelt am Verglach zu onbehandelt Zellen (Lalumi 3d).
Endlech, war den Ausdrock vun VEGF, ee vun den Haapt proangiogenic Faktoren, duerch Western blotting analyséiert. DEET huet VEGF Ausdrock wesentlech erhéicht, wärend pFHHSiD dësen Ausdrock komplett blockéiert huet.
Zënter datt d'Effekter vum DEET empfindlech sinn fir béid pharmakologesch Blockade an Downregulatioun vu M3 Rezeptoren, hu mir d'Hypothese getest datt DEET d'Kalziumsignaléierung kéint verbesseren. Iwwerraschend, DEET gescheitert cytoplasmic Kalzium zu HUVEC (Donnéeën net gewisen) an HEK /M3 (Lalumi 4a, b) fir béid Konzentratioune benotzt.
Post Zäit: Dez-30-2024