Den Anthelmintikum N,N-Diethyl-m-toluamid (DEET) gouf bericht als hemmend fir AChE (Acetylcholinesterase) an huet potenziell karzinogen Eegeschafte wéinst exzessiver Vaskulariséierung. An dëser Publikatioun weisen mir datt DEET spezifesch Endothelzellen stimuléiert, déi Angiogenese förderen, wouduerch d'Tumorwuesstum erhéicht gëtt. DEET aktivéiert zellulär Prozesser, déi zu Angiogenese féieren, dorënner Proliferatioun, Migratioun an Adhäsioun. Dëst ass mat enger erhéichter NO-Produktioun an VEGF-Expressioun an Endothelzellen assoziéiert. D'Ausschalten vun M3 oder d'Benotzung vu pharmakologeschen M3-Inhibitoren huet all dës Effekter ofgeschaaft, wat drop hiweist datt DEET-induzéiert Angiogenese M3-empfindlech ass. Experimenter mat Kalziumsignalgebung an Endothel- an HEK-Zellen, déi M3-Rezeptoren iwwerdriwwen ausdrécken, souwéi Bindungs- an Dockingstudien, weisen datt DEET als allosteresche Modulator vun M3-Rezeptoren wierkt. Ausserdeem hemmt DEET AChE, wouduerch d'Bioverfügbarkeet vun Acetylcholin a seng Bindung un M3-Rezeptoren erhéicht gëtt, an d'proangiogen Effekter duerch allosteresch Reguléierung verstäerkt ginn.
Primär ECe goufen aus der Aorta vu Schwäizer Mais isoléiert. D'Extraktiounsmethod gouf vum Kobayashi Protokoll 26 adaptéiert. Maus-ECe goufen an EBM-2 Medium kultivéiert, dat mat 5% hëtzeinaktivéiertem FBS bis zur véierter Passage ergänzt gouf.
Den Effekt vun zwou Konzentratioune vun DEET op d'Proliferatioun vun HUVEC, U87MG oder BF16F10 gouf mat dem CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026) analyséiert. Kuerz gesot, goufen 5,103 Zellen pro Brunn an eng 96-Brunn-Plack ausgesaat, iwwer Nuecht hänke gelooss an duerno 24 Stonnen mat DEET behandelt. Nodeems de Wuesstumsmedium ewechgeholl gouf, gëtt eng Faarfbindungsléisung an all Brunn vun der Mikroplack bäigefüügt an d'Zellen 30 Minutte bei 37 °C inkubéiert. D'Fluoreszenzniveauen goufen mat engem Mithras LB940 Multimode-Mikroplackelieser (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Däitschland) bestëmmt, deen mat 485 nm Anregungsfilteren an 530 nm Emissiounsfilteren ausgestatt war.
HUVEC goufen a 96-Well-Platten mat enger Dicht vun 104 Zellen pro Well ausgesaat. D'Zellen goufen 24 Stonnen mat DEET behandelt. D'Zellviabilitéit gouf mat engem kolorimetreschen MTT-Assay (Sigma-Aldrich, M5655) bewäert. D'optesch Dichtwäerter goufen op engem Multimode-Mikroplattelieser (Mithras LB940) bei enger Wellelängt vu 570 nm erhalen.
D'Effekter vum DEET goufen mat Hëllef vun In-vitro-Angiogenese-Assays ënnersicht. D'Behandlung mat 10-8 M oder 10-5 M DEET huet d'Bildung vun der Kapillärlängt an HUVECs erhéicht (Fig. 1a, b, wäiss Balken). Am Verglach mat der Kontrollgrupp huet d'Behandlung mat DEET-Konzentratioune vun 10-14 bis 10-5 M gewisen, datt d'Kapillärlängt e Plateau bei 10-8 M DEET erreecht huet (Ergänzungsfig. S2). Et gouf kee signifikanten Ënnerscheed am In-vitro-proangiogenen Effekt vun HUVECs fonnt, déi mat DEET am Konzentratiounsberäich vun 10-8 M an 10-5 M behandelt goufen.
Fir den Effekt vum DEET op d'Neovaskulariséierung ze bestëmmen, hu mir in vivo Neovaskulariséierungsstudien duerchgefouert. No 14 Deeg hunn d'Mais, déi mat Endothelzellen injizéiert goufen, déi mat 10-8 M oder 10-5 M DEET virkultivéiert goufen, eng bedeitend Erhéijung vum Hämoglobingehalt gewisen (Fig. 1c, wäiss Balken).
Ausserdeem gouf DEET-induzéiert Neovaskulariséierung a Mais mat U87MG Xenograft ënnersicht, déi all Dag (ip) mat DEET an enger Dosis injizéiert goufen, déi bekannt ass fir Plasmakonzentratioune vun 10-5 M ze induzéieren, wat bei exponéierte Mënschen normal ass. an 23. Noweisbar Tumoren (dh Tumoren >100 mm3) goufen 14 Deeg no der Injektioun vun U87MG Zellen a Mais observéiert. Um 28. Dag war den Tumorwuesstum bei DEET-behandelte Mais am Verglach mat Kontrollmais signifikant erhéicht (Fig. 1d, Quadraten). Ausserdeem huet d'CD31-Färbung vun Tumoren gewisen, datt DEET d'Kapillarfläch signifikant erhéicht huet, awer net d'Mikrogefässdicht. (Fig. 1e-g).
Fir d'Roll vu muskarinesche Rezeptoren an der DETA-induzéierter Proliferatioun ze bestëmmen, gouf 10-8 M oder 10-5 M DETA a Präsenz vu pFHHSiD (10-7 M, en selektiven M3-Rezeptor-Antagonist) benotzt. Behandlung vun HUVEC. pFHHSiD huet d'proliferativ Eegeschafte vun DETA a alle Konzentratioune komplett blockéiert (Tabell 1).
Ënner dëse Konditioune hu mir och ënnersicht, ob DEET d'Kapillärlängt an HUVEC-Zellen erhéije géif. Ähnlech huet pFHHSiD d'DEET-induzéiert Kapillärlängt signifikant verhënnert (Fig. 1a, b, gro Balken). Ausserdeem goufen ähnlech Experimenter mat M3 siRNA duerchgefouert. Och wann d'Kontroll-siRNA net effektiv war fir d'Kapillärbildung ze förderen, huet d'Ausschalten vum M3-Muskarinrezeptor d'Fäegkeet vum DEET, d'Kapillärlängt ze erhéijen, ofgeschaaft (Fig. 1a, b, schwaarz Balken).
Ausserdeem goufen souwuel d'10-8 M oder 10-5 M DEET-induzéiert Vaskulariséierung in vitro wéi och d'Neovaskulariséierung in vivo komplett duerch pFHHSiD blockéiert (Fig. 1c, d, Kreeser). Dës Resultater weisen drop hin, datt DEET d'Angiogenese iwwer e Wee fördert, deen empfindlech op selektiv M3-Rezeptor-Antagonisten oder M3 siRNA reagéiert.
AChE ass dat molekular Zil vum DEET. Medikamenter wéi Donepezil, déi als AChE-Inhibitoren wierken, kënnen d'EC-Angiogenese in vitro an a Maus-Hënneschtbeen-Ischämiemodeller stimuléieren14. Mir hunn den Effekt vun zwou Konzentratioune vun DEET op d'AChE-Enzymaktivitéit an HUVEC getest. Niddreg (10-8 M) an héich (10-5 M) Konzentratioune vun DEET hunn d'endothelial AChE-Aktivitéit am Verglach mat Kontrollbedingungen erofgesat (Fig. 2).
Béid Konzentratioune vun DEET (10-8 M an 10-5 M) hunn d'Acetylcholinesterase-Aktivitéit op HUVEC reduzéiert. BW284c51 (10-5 M) gouf als Kontroll fir Acetylcholinesterase-Inhibitoren benotzt. D'Resultater ginn als Prozentsaz vun der AChE-Aktivitéit op HUVEC ausgedréckt, déi mat den zwou Konzentratioune vun DEET behandelt goufen, am Verglach mat Zellen, déi mat engem Vehikel behandelt goufen. D'Wäerter ginn als Moyenne ± SEM vu sechs onofhängege Experimenter ausgedréckt. *p < 0,05 am Verglach mat der Kontroll (Kruskal-Wallis an Dunn Multiple-Vergläichstest).
Stickstoffmonoxid (NO) ass am angiogenesche Prozess bedeelegt 33, dofir gouf d'NO-Produktioun an DEET-stimuléierten HUVECs ënnersicht. D'DEET-behandelt endothelial NO-Produktioun war am Verglach mat Kontrollzellen erhéicht, huet awer nëmmen bei enger Dosis vun 10-8 M bedeitend Konsequenze erreecht (Fig. 3c). Fir déi molekular Ännerungen ze bestëmmen, déi d'DEET-induzéiert NO-Produktioun kontrolléieren, goufen d'eNOS-Expressioun an d'Aktivatioun duerch Western Blotting analyséiert. Och wann d'DEET-Behandlung d'eNOS-Expressioun net verännert huet, huet se d'eNOS-Phosphoryléierung op senger Aktivéierungsplaz (Ser-1177) signifikant erhéicht, während se hir Inhibitorplaz (Thr-495) am Verglach mat onbehandelten Zellen an der eNOS-Phosphoryléierung reduzéiert huet (Fig. 3d). Ausserdeem gouf de Verhältnis vu phosphoryléiertem eNOS op der Aktivéierungsplaz an der Inhibitorplaz berechent, nodeems d'Quantitéit vu phosphoryléiertem eNOS zu der Gesamtquantitéit vum Enzym normaliséiert gouf. Dëst Verhältnis war an HUVECs, déi mat all Konzentratioun vun DEET behandelt goufen, am Verglach mat onbehandelten Zellen signifikant erhéicht (Fig. 3d).
Schlussendlech gouf d'Expressioun vu VEGF, ee vun den Haaptproangiogenen Faktoren, duerch Western Blotting analyséiert. DEET huet d'VEGF-Expressioun däitlech erhéicht, während pFHHSiD dës Expressioun komplett blockéiert huet.
Well d'Effekter vum DEET souwuel op d'pharmakologesch Blockad wéi och op d'Downreguléierung vun M3-Rezeptoren empfindlech sinn, hu mir d'Hypothes getest, datt DEET d'Kalziumsignalgebung kéint verbesseren. Iwwerraschenderweis konnt DEET net d'zytoplasmatescht Kalzium an HUVEC (Donnéeën net gewisen) an HEK/M3 (Fig. 4a, b) fir béid benotzt Konzentratioune erhéijen.
Zäitpunkt vun der Verëffentlechung: 30. Dezember 2024