Pestiziden spille eng entscheedend Roll bei der Bekämpfung vu globale Liewensmëttelknappheet a bei der Bekämpfung vu Vektor-iwwerdroene Krankheeten, déi beim Mënsch duerch Vektoren iwwerdroe ginn. Wéinst dem wuessende Problem vun der Pestizidresistenz ass awer dréngend d'Entdeckung vun neie Verbindungen noutwendeg, déi sech op ënnerausgenotzt Ziler abzielen. Transient Rezeptor Potential Kanäl (TRPV) vun Insekten - Nanzhong (Nan) an inaktiv (Iav) - kënnen heterolog Kanäl (Nan-Iav) bilden a sech op mechanosensoresch Organer lokaliséieren, déi Geotropismus, Gehéier a Proprioceptioun bei Insekten vermëttelen. Verschidde Pestiziden, wéi Aphidopyrrolidon (AP), abzielen op Nan-Iav duerch onbekannt Mechanismen. AP ass effektiv géint piercing-saugend Insekten (Hemipteranen), verhënnert d'Ernierung andeems et d'Funktioun vun de Filamenter stéiert. AP kann nëmmen un Nan bannen, awer nëmmen Nan-Iav kann mat Agonisten, dorënner endogenen Nikotinamid (NAM), interagéieren an doduerch Kanalaktivitéit weisen. Trotz dem Potenzial vum Nan-Iav als Insektizidzil ass wéineg iwwer seng Kanalopbau, regulatoresch Bindungsplazen a Ca2+-ofhängeg Reguléierung bekannt, wat déi weider Entwécklung vun Insektiziden behënnert. An dëser Studie gouf Kryo-Elektronemikroskopie benotzt fir d'Struktur vun Nan-Iav an Hemiptera-Insekten am Calmodulin-Ligand-fräien Zoustand ze bestëmmen, souwéi mat AP an NAM op der Grenz vum Ankyrin-Wiederholungszytoplasmatesche Beräich (ARD). Iwwerraschenderweis hu mir festgestallt, datt d'Nan-Protein selwer e Pentamer ka bilden, deen duerch AP-vermittelten ARD-Interaktiounen stabiliséiert gëtt. Dës Studie weist molekular Interaktiounen tëscht Insektiziden an Agonisten an Nan-Iav op, wat d'Wichtegkeet vun ARD an der Kanalfunktioun an -assembléierung ervirhieft, an de Mechanismus vun der Ca2+-Reguléierung ënnersicht.
Virum Hannergrond vum ëmmer méi schwéiere globale Klimawandel ass déi verschlechtert global Liewensmëttelsécherheet eng vun de gréissten Erausfuerderunge vum 21. Joerhonnert, mat kaskadéierende Konsequenze fir d'Gesellschaft.1,2De Bericht vun der Weltgesondheetsorganisatioun "State of Food Security and Nutrition in the World 2023" (SOFI) schätzt, datt ongeféier 2,33 Milliarde Mënsche weltwäit ënner mëttelstaarker bis schwéierer Liewensmëttelonsécherheet leiden, engem laangjärege Problem.3,4Leider ginn all Joer tëscht 20% an 30% oder méi vun den Ernteerträg duerch Schädlinge a Pathogenen verluer, an et gëtt erwaart, datt d'global Erwiermung d'Resistenz vun de Schädlinge an d'Vulnerabilitéit vun de Kulturen verschäerft.4, 5, 6, 7, 8D'Entwécklung vu Pestiziden ass net nëmme wichteg fir Kulturen viru Schädlinge ze schützen an d'Verbreedung vu vektorgebonnene Pathogenen ze reduzéieren, mä och fir d'Bekämpfung vu vektorgebonnene mënschleche Krankheeten wéi Dengueféiwer, Malaria a Chagas-Krankheet, déi ëmmer méi resistent géint Pestiziden sinn.5,9,10,11
Zu den Haaptziler vun neurotoxeschen Insektiziden representéiert den heterotetramereschen TRPV-Kanal Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) eng Klass vun Insektizidziler, déi eréischt an der leschter Dekade entdeckt goufen, dorënner kommerziell verfügbar Insektiziden wéi Imidacloprid a Pyraclostrobin.12,13,14Dat semisynthetescht Insektizid Aphidopyrrolifen (AP) ass e kierzlech entwéckelt a kommerzialiséiert Produkt, deem säin Haaptbestanddeel den aktiven Insektizid Inscalis® ass, deen AP op engem subnanomolare Aktivitéitsniveau bindt.15AP weist eng niddreg akut Toxizitéit fir Bestäuber, nëtzlech Insekten an aner Net-Zilorganismen op, a wann et no den Instruktioune um Etikett benotzt gëtt, kann et de Resistenzdrock géint aner Insektiziden reduzéieren.16,17,18Nan an Iav si wäit iwwer Insektenarten verdeelt, ginn nëmme co-expriméiert a chordalen Dehnungsrezeptorneuronen vun den Antennen a Glidder, a si entscheedend fir d'Héieren, d'Schwéierkraaftwahrnehmung an d'Proprioceptioun.13,16,19,20,21,22AP, Imidacloprid a Pyraclostrobin stimuléieren den Nan-Iav-Komplex duerch en eenzegaartege Mechanismus, wouduerch letztendlech d'propriozeptiv Signaltransduktioun hemmt.13,16,23Bei piercing-saugenden Insekten (Hemipteraen), wéi Blatlais a Wäissfliegen, behënnert de Verloscht vun der Proprioceptioun hir Iessfäegkeet, wat schlussendlech zum Doud féiert.13,24Interessanterweis weist AP eng héich Affinitéit fir den Nan-Iav-Komplex an eng niddreg Affinitéit fir Nan eleng. D'Bindung vun AP un Nan-Iav induzéiert en elektresche Stroum, awer d'Bindung un Nan eleng stimuléiert keng Kanalaktivitéit. Iav selwer bindt guer net un AP.16Dëst weist drop hin, datt Nan an Iav sech bannen a verschidde Nan-Iav Kanalkomplexe bilden (z.B. mat verschiddene stöchiometresche Verhältnisser oder verschiddenen Arrangementer bannent dem selwechte stöchiometresche Verhältnis) oder datt AP sech un verschidde Plaze bannen kann. Ausserdeem bindt den natierlechen Agonist Nikotinamid (NAM) sech mat mikromolarer Affinitéit un Drosophila Nan-Iav a weist Effekter ähnlech wéi déi vu Blatlais (AP) in vitro.16,25an d'Blatlaisreproduktioun an d'Ernährung hemmen, wat schlussendlech zu hirem Doud féiert25,26Dës Donnéeën werfen vill Froen op. Zum Beispill bleift et onkloer, wéi den Nan-Iav Heterodimer geformt gëtt, wéi eng Bindungsplaze benotzt gi fir kleng Molekülen ze moduléieren, a wéi dës kleng Molekülen d'Kanalfunktioun reguléieren andeems se d'Proprioceptioun ënnerdrécken. Ausserdeem bleiwen d'Grënn, firwat Nan selwer inaktiv ass an eng niddreg Affinitéit fir AP huet, während den Nan-Iav Heterodimer aktiv ass an AP mat méi héijer Affinitéit bindt, onkloer. Schlussendlech ass wéineg iwwer déi Ca2+-ofhängeg Reguléierung vun der Nan-Iav Funktioun bekannt a wéi se an neuronal Signalprozesser integréiert ass.. 13,21
An dëser Studie, an där mir Kryo-Elektronemikroskopie, Elektrophysiologie a Radioligand-Bindungstechnike kombinéiert hunn, hu mir d'Zesummesetzung vun Nan-Iav an de Mechanismus vu senger Bindung u Klengmolekülregulatoren opgekläert. Ausserdeem hu mir konstitutiv gebonnen Calmodulin (CaM) un Iav an AP-stabiliséiert Nan-Pentameren detektéiert. Dës Resultater liwweren wichteg Abléck an d'Reguléierung vu Kalziumionen a Kanäl, d'Kanalzesummesetzung an d'Faktoren, déi d'Ligand-Bindungsaffinitéit bestëmmen. Méi wichteg ass, datt mir bestätegt hunn, datt ARD eng zentral Roll an dëse Prozesser spillt. Eis Studie vu komplette Insektenkanäl, déi u relevant landwirtschaftlech Pestiziden gebonne sinn.27, 28, 29mécht Perspektiven op fir d'Entwécklung vun der Pestizidindustrie, verbessert d'Effizienz a Spezifizitéit vu Pestiziden, an erméiglecht d'Applikatioun vun TRPV-gezielte Verbindungen op aner Aarten, fir d'global Liewensmëttelsécherheet an d'Verbreedung vu Vektor-iwwerdroene Krankheeten ze bekämpfen.
Mir hunn och festgestallt, datt Nan-Iav duerch Ca2+ reguléiert gëtt, an de Mechanismus vun der Reguléierung duerch konstitutiv gebonnen CaM vermittelt gëtt. Wichteg ass, datt dës Ca2+-ofhängeg Reguléierung vun Nav duerch CaM sech wesentlech vun de Mechanismen vun der Reguléierung vun aneren Ionenkanäl ënnerscheet (z. B. spannungsgesteiert Na+ Kanäl an TRPV5/6 Kanäl).52, 53, 54, 55, 56, 57Am Nav1.2 Kanal assoziéiert sech den C-terminalen Domän vum CaM helix mam C-terminalen Domän (CTD), a Ca2+ induzéiert d'Bindung vu sengem N-terminalen Domän un den distalen Deel vum CTD.56Am TRPV5/6 Kanal bindt sech den C-terminalen Domän vum CaM un CTH, a Ca2+ induzéiert eng no uewe verlängert Verlängerung vu sengem N-terminalen Domän an d'Pore, wouduerch d'Kationpermeabilitéit blockéiert gëtt.53,54Mir proposéieren e Modell fir déi Ca2+-reguléiert Funktioun vun Nan-Iav-CaM (Fig. 4h). An dësem Modell bindt den N-terminalen Domän vu CaM konstitutiv un den C-terminalen Domän (CTH) vun Iav. Am Rouzoustand (niddreg [Ca2+] Konzentratioun) interagéiert den C-terminalen Domän vu CaM mat Nan, stabiliséiert d'ARD-Konformatioun an doduerch fërdert d'Kanalöffnung. D'Bindung vun engem Agonist/Insektizid un de Kanal induzéiert d'Porenöffnung, wat zu engem Ca2+-Influx féiert. Ca2+ bindt sech dann un CaM, wouduerch d'Dissoziatioun vum C-terminalen Domän vum ARD vun Nan verursaacht gëtt. Well d'Blockéierung vun der CaM-Bindung am Fong den inhibitoreschen Effekt vu Ca2+ ofschaaft, moduléiert dës Dissoziatioun d'ARD-Mobilitéit, wouduerch eng Ca2+-ofhängeg Inhibitioun oder Desensibiliséierung verursaacht gëtt. Déi séier Erhuelung vun de Kanalstréim no der Kalziumionen-Elutioun (Fig. 4g) weist drop hin, datt dëse Mechanismus séier Reaktiounen op Ca2+-vermittelten neuronal Signaler erliichtert. Ausserdeem gouf bericht, datt d'C-terminal Regioun vum Iav, déi nach ëmmer schlecht verstanen ass, aner Rollen am Kanalzielverhalen an der aktueller Reguléierung spillt.21
Schlussendlech presentéiert eis Studie déi héichopléisend Struktur vun engem Insektizid-Insektizid TRP-Kanalkomplex vu landwirtschaftlecher Bedeitung - eng Entdeckung, déi eis virdru onbekannt war. Besonnesch ass et ze bemierken, datt mir d'Struktur a Funktioun vum Insektenkanal a mënschleche Zellen (HEK293S GnTi–) charakteriséiert hunn, anstatt an Insektenzellen. Am Gesiicht vun der wuessender Insektizidresistenz an dem stännegen Drock op d'Liewensmëttelsécherheet a Pathogenen liwwert eis Aarbecht wichteg Informatiounen, déi d'Entwécklung vun neien Insektiziden zum Wuel vun der mënschlecher Gesondheet an der globaler Liewensmëttelsécherheet erliichteren. Studien hunn gewisen, datt Insektiziden wéi AP géint verschidde Schädlinge effektiv sinn, wa se no den Instruktioune um Etikett benotzt ginn, an eng niddreg akut Toxizitéit fir nëtzlech Bestäuber hunn, wat hir Ëmweltsécherheet beweist.13,16Ausserdeem huet d'Tester vun e puer AP-Derivater op Moustiquen gewisen, datt se schlussendlech hir Fäegkeet verléieren ze fléien. D'Verstoe wéi dës moduléierend Verbindungen un Nan-Iav binden, wäert d'Modifikatioun vun existente Verbindungen oder d'Entwécklung vun neie Verbindungen fir méi effektiv an ... erliichteren.präzisSchädlingsbekämpfung. Eis Studie weist, datt d'Nan-Iav ARD-Grenzfläche net nëmme fir d'Reguléierung vun der Aktivitéit vun endogenen Verbindungen, Pestiziden a Ca2+-CaM entscheedend ass, mä och fir d'Kanalbildung. Mir proposéieren, datt d'Stéierung vun der Heterodimerbildung mat klenge Molekülen eng eenzegaarteg a villverspriechend Approche fir d'Entwécklung vun Ionenkanalinhibitoren kéint sinn.
Vun den aacht orthologen Genen goufen déi volllängeg Genen vum brongen Käfer (Halyomorpha halys) Nanchung an Inactive ausgewielt, déi eng exzellent Stabilitéit an Detergentien opweisen. Déi synthetiséiert Genen goufen fir mënschlech Expressioun codonoptimiséiert a mat Hëllef vun XhoI- an EcoRI-Restriktiounsplazen an de pBacMam pCMV-DEST-Vektor (Life Technologies) geklont. Dëst huet garantéiert, datt d'Klonen am Frame mat den C-terminalen GFP-FLAG-10xHis- an mCherry-FLAG-10xHis-Tags waren, déi vun der HRC-3C-Protease (PPX) gespalten ginn, wat onofhängeg ... erméiglecht.AusdrockD'Primeren, déi benotzt goufen, fir Nanchung an Inactive an de pBacMam Vektor ze klonen, waren wéi follegt:
Mikroskopesch Biller vun eenzelne Partikelen goufen op engem Titan Krios G2 Transmissiounselektronemikroskop (FEI) opgeholl, deen mat enger K3 Kamera an engem Gatan BioQuantum Energiefilter ausgestatt war. De Mikroskop gouf mat 300 keV bedriwwen, mat enger Energieastellung vun 20 eV, enger Proufpixelgréisst vun 1,08 Å/Pixel (nominal Vergréisserung vun 81.000x) an engem Defokusgradient vun -0,8 bis -2,2 μm. D'Videoopnam gouf mat 40 Biller pro Sekonn mat engem Latitude S Mikroskop (Gatan) mat enger nomineller Dosisrate vun 25 e–px−1 s−1, enger Beliichtungszäit vun 2,4 s an enger Gesamtdosis vun ongeféier 60 e–Å−2 duerchgefouert.
Strahlinduzéiert Bewegungskorrektur a Dosisgewichtung goufen op Film mat MotionCor2 a RELION 4.061 duerchgefouert. D'Schätzung vun der Kontrasttransferfunktioun (CTF) Parameter gouf a CryoSPARC mat der Patch-baséierter CTF-Schätzungsmethod62 duerchgefouert. Photomikrografie mat enger CTF-Anpassungsopléisung ≥4 Å goufen aus der spéiderer Analyse ausgeschloss. Typesch gouf eng Ënnergrupp vu 500–1000 Photomikrografie fir d'Punktauswiel a CryoSPARC benotzt, gefollegt vu verschiddene Ronnen vun 2D-Klassifikatioun no der Filterung fir e kloert Referenzbild fir d'Schabloun-baséiert Partikelauswiel ze kréien. D'Partikel goufen dann mat 64-Pixel-Begrenzungsboxen a 4-fache Binning extrahéiert. Verschidde Ronnen vun 2D-Klassifikatioun goufen duerchgefouert fir ongewollt Partikelkategorien ze entfernen. Den initialen 3D-Modell gouf mat ab initio Rekonstruktioun rekonstruéiert a mat net-uniforme Raffinesse a CryoSPARC verfeinert. D'3D-Klassifikatioun gouf a CryoSPARC oder RELION baséiert op ARD-Heterogenitéit duerchgefouert. Keng bedeitend Heterogenitéit vun de Membrandomänen gouf observéiert. D'Partikel goufen mat de C1- an C2-Methoden verfeinert; Partikelen mat enger méi héijer C2-Opléisung goufen als symmetresch am Verhältnes zu C2 ugesinn an an RELION fir Bayesianesch Verfeinerung importéiert. D'Partikelen goufen dann zréck an de KryoSPARC transferéiert fir eng final net-uniform a lokal Verfeinerung. Déi final Opléisung an d'Partikelzuelen sinn an der Tabell 1 gewisen.
Bei der Veraarbechtung vun Nan+AP-Pentameren hu mir verschidde Methoden ënnersicht, fir d'Opléisung vun de Membrandomänen (besonnesch der Porenregioun) ze verbesseren, wéi z. B. Signalsubtraktioun an TMD-Maskéierung. Dës Versich waren awer net erfollegräich wéinst der potenziell extremer Stéierung an der Porenregioun an der allgemenger Heterogenitéit vum TMD. Déi endgülteg Opléisung gouf mat enger Mask berechent, déi automatesch vun der net-uniformer Veraarbechtungsmethod am CryoSPARC generéiert gouf, haaptsächlech op d'ARD-Regioun geriicht. Doduerch gouf eng däitlech méi héich Opléisung erreecht wéi déi vun de Membrandomänen (besonnesch der VSLD-Regioun).
Initial de novo Modeller vun den Apo-Formen vun den Nanchung- an Inaktiv-Käfer goufen fir d'éischt mat Coot63 generéiert, an d'Modeller vun den Nan- an Iav-Käfer goufen mat AlphaFold264 generéiert fir Regiounen mat nidderegem Vertrauen z'identifizéieren. D'Calmodulin-Modelléierung baséiert op rigid-body-Upassungen vun de Ca2+-bindenden a Ca2+-fräie Modeller an de PDB-Accessiounen 4JPZ56 respektiv 1CFD65. D'Modeller goufen duerch sphäresch Verfeinerung verfeinert fir déi korrekt Stereochemie an eng gutt Geometrie ze garantéieren. Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin a Phosphatidylserin goufen dann als gutt definéiert Lipiddichten modeléiert, an d'NAM- an AP-Liganden goufen an den entspriechenden Dichten an den enk verbonnenen Junctions placéiert. Constraint-Dateie goufen aus dem SMILES-String vun den Isoformen mat eLBOW a PHENIX66 generéiert. Schlussendlech goufen d'Modeller am realen Raum a PHENIX verfeinert mat lokaler Gittersich a globaler Minimiséierung mat sekundäre Strukturbeschränkungen. De MolProbity Server gouf fir d'Modellverfeinerung an d'Strukturanalyse benotzt, an Illustratioune goufe mat PyMOL an UCSF Chimera X duerchgefouert. 67,68,69 Aperturanalyse gouf mam HOLE Server duerchgefouert,70 an d'Sequenzkonservatiounsmapping gouf mam Consurf Server duerchgefouert.71
Déi statistesch Analyse gouf mat Igor Pro 6.2, Excel Office 365 a GraphPad Prism 7.0 duerchgefouert. All quantitativ Donnéeë ginn als Mëttelwäert ± Standardfehler (SEM) duergestallt. De Student's t-Test (zweisäiteg, ongepaart) gouf benotzt fir zwou Gruppen ze vergläichen. Eng Een-Wee-Varianzanalyse (ANOVA) gefollegt vum Dunnett's Post-hoc-Test gouf benotzt fir verschidde Gruppen ze vergläichen. *P< 0,05, **P< 0,01, an ***P< 0,001 goufen als statistesch signifikant ugesinn, ofhängeg vun der Datenverdeelung. Kd-, Ki-Wäerter an hir asymmetresch 95%-Konfidenzintervaller goufen mat GraphPad Prism 10 berechent.
Fir méi Detailer iwwer d'Studiemethodologie, kuckt w.e.g. d'Zesummefassung vum Nature Portfolio Report, op déi an dësem Artikel verlinkt ass.
Dat ursprénglecht Modell gouf mat de Calmodulin-Modeller aus den PDB 4JPZ- an 1CFD-Datebanken gebaut. D'Koordinaten goufen an der Protein Data Bank (PDB) ënner den Zougangsnummeren 9NVN (Nan-Iav-CaM ouni Ligand), 9NVO (Nan-Iav-CaM gebonnen un Nikotinamid), 9NVP (Nan-Iav-CaM gebonnen un Nikotinamid an EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM gebonnen un Aphenidolpyrrollin a Kalzium), 9NVR (Nan-Iav-CaM gebonnen un Aphenidolpyrrollin an EDTA) an 9NVS (Nan-Pentamer gebonnen un Aphenidolpyrrollin) deposéiert. Déi entspriechend Kryo-Elektronemikroskopie-Biller sinn an der Elektronenmikroskopie-Datebank (EMDB) ënner de folgende Zougangsnummeren deposéiert: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM ouni Ligand), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM-Komplex mat Nikotinamid), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM-Komplex mat Nikotinamid an EDTA), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM-Komplex mat Aphidopyrrollin a Kalzium), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM-Komplex mat Aphidopyrrollin an EDTA) an EMD-49849 (Nan-Pentamer-Komplex mat Aphidopyrrollin). D'Réidaten fir déi funktionell Analyse ginn an dëser Aarbecht presentéiert.
Zäitpunkt vun der Verëffentlechung: 28. Januar 2026